单环刺螠转录因子基因Sp8的克隆_原核表达和重组蛋白纯化_史晓丽

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1、中国海洋大学学报第４３卷第５期４３（５）：０５２～０５８２０１３年５月ＰＥＲＩＯＤＩＣＡＬＯＦＯＣＥＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＣＨＩＮＡＭａｙ，２０１３单环刺螠转录因子基因Ｓｐ８的克隆、＊原核表达和重组蛋白纯化＊＊史晓丽，刘晓龙，张立涛，张志峰（中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室，山东青岛２６６００３）摘要：转录因子Ｓｐ是一类广泛存在的锌指蛋白超家族成员，可与某些基因的上游调控序列结合，参与基因的转录调控。本研究采用同源克隆和ＲＡＣＥ技术，获得单环刺螠的Ｓｐ８的全长ｃＤＮＡ，该序列长１９１３ｂｐ，开放阅读框１５２１ｂｐ，

2、编码５０６个氨基酸；将其开放阅读框ｃＤＮＡ克隆到原核表达载体ｐＥＴ２８ａ中，并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，在３７℃条件下，经１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导表达４ｈ，获得以包涵体形式存在的重组蛋白ｐＥＴ２８ａ－ＳＰ，使用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体，并通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析该蛋白的分子量约为５０ｋＤ。Ｓｐ８蛋白体外表达的成功将为研究单环刺螠相关基因的转录调控打下基础。关键词：单环刺螠；Ｓｐ８；转录因子；克隆；原核表达中图法分类号：Ｑ７８６文献标志码：Ａ文章编号：１６７２－５１７４（２０１３）

3、０５－０５２－０７转录因子Ｓｐ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｐｒｏｔｅｉｎ）是锌指蛋白超家键酶－硫醌氧化还原酶（Ｓｕｌｆｉｄｅ：ｑｕｉｎｉｎｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃ－族中的一个家族，参与细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤ｔａｓｅ，ＳＱＲ）基因的上游序列中存在多个潜在的转录因［１］发生等多种生理、病理过程。该家族显著的序列特子结合位点，生物信息学预测Ｓｐ８是其可能的转录因点是：羧基末端高度保守，含有３个串联的Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２锌子之一。为此本文克隆了单环刺螠Ｓｐ８基因的全长指结构，能结合ＤＮＡ上的ＣＡＣＣＣ元件或ＧＣ盒等序ｃＤＮＡ，并通过体外原核表达

4、获得了该蛋白，为后续研列；氨基末端在不同的家族成员间差异较大，主要是通究其对ｓｑｒ基因的转录调控奠定基础。［２］过结合辅助因子发挥转录调控作用。迄今已发现多１材料与方法［３］种Ｓｐ蛋白，不同物种中Ｓｐ蛋白的种类以及参与调［４］控的基因种类和生物学功能调控均存在差异。１．１材料转录因子Ｓｐ８是Ｓｐ家族成员之一，其Ｎ端有一单环刺螠购自青岛市四方区海产品市场，产地为个丝氨酸／苏氨酸富集区，羧基端有３个串联的锌指结烟台莱州沿海。大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株和原核表构和１个Ｂｔｄｂｏｘ。目前对Ｓｐ８的研究多集中在人、小达载体ｐＥＴ２８ａ为本

5、实验室保存。限制性核酸内切酶鼠、鸡和斑马鱼等脊椎动物的表达和功能研究，尤其在ＨａｅⅢ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ、ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｍ－［５－８］脊椎动物附肢形成方面研究较深入。无脊椎动物ＭＬＶ反转录酶、ｐＭＤ１８－Ｔｓｉｍｐｌｅ载体、蛋白分子量标仅在线虫、囊舌虫、小头虫等少数几个物种中有核酸序准等购自大连Ｔａｋａｒａ公司。ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥｃＤＮＡ［４，１１］２＋列的报道，尚未见相关的功能分析。试剂盒购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。镍离子金属螯合柱（Ｎｉ－单环刺螠（Ｕｒｅｃｈｉｓｕｎｉｃｉｎｃｔｕｓ）俗称海肠子，隶属ＮＴＡ）购自Ｎｏ

6、ｖａｇｅｎ公司。于螠虫动物门（Ｅｃｈｉｕｒａ）、无管螠目（Ｘｅｎｏｐｎｅｕｓｔａ）、刺１．２总ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ第一链的合成螠属（Ｕｒｅｃｈｉｓ），主要分布于俄罗斯、日本北海道和本州按照分子克隆实验指南的方法提取单环刺螠肛门岛、朝鲜半岛和我国黄渤海沿岸，是一种生活在沿海泥囊总ＲＮＡ，ＤＮａｓｅⅠ消化，纯化后的ＲＮＡ经琼脂糖凝沙岸潮间带下区及潮下带浅水区Ｕ型穴道内的底栖生胶电泳和紫外分光光度计检测质量后，参考Ｍ－ＭＬＶ［９］物种。本实验室前期研究发现，单环刺螠硫代谢关反转录酶说明书将ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，－２０℃保＊基金项目：国家

7、自然科学基金项目（３１０７２１９１）资助收稿日期：２０１２－０２－０７；修订日期：２０１２－０４－２７作者简介：史晓丽（１９８４－），女，博士生，研究方向：细胞生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｉｘｉａｏｌｉ２０９＠１６３．ｃｏｍ＊＊通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｚｆｐ１０７＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ５期史晓丽，等：单环刺螠转录因子基因Ｓｐ８的克隆、原核表达和重组蛋白纯化５３存。ＨｉｎｄⅢ双酶切，回收片段后连接、转化入大肠杆菌１．３全长ｃＤＮＡ序列的获得ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，３７℃培养过夜。挑菌培养，根据ＧｅｎＢａｎｋ数据库中人、小鼠、非洲

8、爪蟾、斑马提取质粒，ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定阳性克隆。鱼、海鞘、紫色球海胆、小头虫的Ｓｐ基因的氨基酸序列１．６目的基因的诱导表达及鉴定和ｃＤＮＡ序列，选择保守性高的位点设计２对简并引阳性菌株在含卡那霉素（３０μｇ／ｍＬ）的ＬＢ