单环刺螠(urechis unicinctus)受精过程的细胞学观察和硫氰酸酶基因的克隆与表达

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1、中国海洋大学硕士学位论文单环刺螠（Urechisunicinctus）受精过程的细胞学观察和硫氰酸酶基因的克隆与表达姓名：董英萍申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：张志峰201106中国海洋大学硕士学位论文单环刺嗌(Urechisunicinctus)受精过程的细胞学观察和硫氰酸酶基因的克隆与表达摘要本论文包括两部分，第一部分是单环刺蜢受精过程的细胞学研究，第二部分是单环刺蜢硫氰酸酶基因的克隆及表达。受精标志着生物新个体的诞生，在生物体内，它是单倍体的精子和卵子相互结合而启动胚胎发育的过程。本文第一部分利用组织学和荧光显微镜对单环刺蜢(Urechisunicinctus)受精

2、过程中精子入卵以及核相变化进行了观察。结果表明：单环刺蜢成熟卵呈卵圆形，核相处于生发泡尚未破裂的第1次成熟分裂前期。在(21士1)℃的条件下，精卵混合后约5min，精子由卵偏向植物极一侧入卵，受精膜开始举起，继而精核发生第1次膨胀。直至受精后25min左右，受精膜完全举起：受精后10．50min，卵核相继完成2次成熟分裂，分别形成第一极体和第二极体；受精后50一70min，精核卵核分别膨胀，形成雄原核和雌原核，进而相向迁移，最后在卵的中央联合形成合子核。受精后70—90min，受精卵完成第1次卵裂，形成两个大小相等的卵裂球。单环刺蜢受精全过程历时约70min，略长于多数海洋无脊椎动物

3、的受精持续时间。本研究对单环刺蜢受精过程的观察，丰富了单环刺嗌受精生物学的基础资料内涵，也为其人工育苗和未来的新品种的培育提供理论基础。本文的第二部分内容是克隆了单环刺蜢硫氰酸酶全长eDNA序列，并对其在硫化物应急下的组织表达特性进行了分析。硫氰酸酶(rhodanese)又称硫转移酶(sulfurtransferase)，是线粒体硫化物氧化解毒酶系中的最后一个成员，转移一个过硫化物分子到亚硫酸盐形成终产物硫代硫酸盐。采用同源克隆和RACE技术获得单环刺蜢硫氰酸酶全长eDNA2318bp，其开放阅读框长870bp，编码289个氨基酸，含有保守氨基酸序列(CEVGVT)及保守的催化活性位

4、点Cys230。荧光定量PCR分析该基因在单环刺蜢各组织中的表达量存在差异，其中肛门囊表达量最高，呼吸肠和中肠次之，体腔液细胞和体壁表达量最低；进一步的V11l中国海洋大学硕士学位论文硫化物诱导表达结果显示，单环刺蜢呼吸肠硫氰酸酶mRNA在硫化物暴露(50I．tM和150州)72h内较对照均无显著性差异。本研究成果为深入探讨硫化物代谢的分子机制以及开发单环刺蜢成为沿海硫化物代谢研究的模式生物提供理论依据。关键词：单环刺蜢；受精过程；细胞学；硫化物；硫氰酸酶基因；克隆；表达IXThecytoI。gicalobservationonfertiIizationandthecIoningan

5、dexpressionofrhodaneseinUrechisunidnctusAbstract111jspaperconsists俩。parts，thefirstpartisthecyt。1。gical0bservation。nfenilizationm昕e幽西“刀七加ctus，andtheotheristhecloningandexpression。frhodanese．Fenili刎ionisthefusionofgametestoproduceaneworganism·Inanimals，theprocessinv01vesthefusionofallovumwithaspe

6、rm，whicheVentuallyleadstothedevelopmentofaIlembryo．Inthefirstpartofthispaper,weobseⅣedtllespe粤penetrationintotheoocyteandthechangingofthenuclearphasemUrec九塔甜”iciBe姗usingllist0109yteChniqueandfluorescencemicroscopy．，resuitssbowedthatthematureoocyteofUunicinctuswasegg’shapedalldremainedattheproph

7、aseofthefirstmaturationdivisionwithUlICrackedgerminaJvesicle．SpermSquicklyattachedtothesurfaceoftheoocyteafter咖xmgotge啪cellsat(214-1)℃watertemperature，after5minutesofinseminatlon，thespempene眦dintotheoocyteatthesiteclosetovegetalpo