布鲁氏菌三个外膜脂蛋白的原核表达、纯化及免疫原性实验

《布鲁氏菌三个外膜脂蛋白的原核表达、纯化及免疫原性实验》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、山东农业大学硕士学位论文布鲁氏菌三个外膜脂蛋白的原核表达、纯化及免疫原性实验姓名：马长胜申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：谢之景20120615山东农业大学硕士学位论文摘要布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏菌引起的人畜共患性传染病，严重危害畜牧业发展和人类健康。布鲁氏菌病是全球范围内的公共卫生问题，全世界有超过170多个国家和地区存在人和动物的布鲁氏菌病的流行。近年来，我国对布鲁氏菌病进行的监测和分析，发现布鲁氏菌病疫情暴发形势较为严峻，羊、牛布布鲁氏菌病感染率上升较快，成为法定报告传染病

2、中发病数上升速度最快的疾病之一。布鲁氏菌外膜蛋白在稳定细菌外膜的结构、适应胞内、外环境和抵抗胞内杀菌机制等方面起着重要作用，与细菌的毒力有密切关系。外膜蛋白位于细菌的表面，参与细菌与宿主的相互作用，并且容易被免疫系统识别，激发免疫反应。布鲁氏菌的多种外膜蛋白都具有免疫原性，其中很大一部分是免疫保护抗原。因此，很多有关布鲁氏菌致病机制和免疫反应机制的研究都集中在外膜蛋白的研究上。．j岛．。本研究选取布鲁氏菌外膜三个脂蛋白为研究对象，体外克隆、表达、纯化这三个外膜蛋白，分析其免疫原性，探讨其作为诊断抗原和亚单位疫苗

3、候选蛋白的可行性。本研究根据GenBank中发表的布鲁氏杆菌外膜脂蛋白0MPl0(GenBaIlk：L27995．1)、OMPl6(GenBank：JF918760．1)、OMPl9(GenBank：L27997．1)的基因序列，利用●托DNASTARPrimer5软件分别设计一对特异性引物。在三对引物上游都引入BamHI酶切位点，下游引入HindlII酶切位点。通过煮沸的方法提取了布鲁氏菌疫苗株S19全基因组DNA，以全基因组DNA为模板，用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出了三个脂蛋白的基因片段j大小分别为

4、381bp、507bp、534bp。将扩增的三个目的基因片段分别克隆入pEASY-T3，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5a构建了三个克隆载体：pEASY-T3／OMPl0，pEASY-T3／OMPl6，pEASY-T3／OMPl9。经双酶切鉴定和测序比对正确后，分别提取质粒。用限制性内切酶BamHI和砌棚同时双酶切重组克隆质粒和表达载体pET-32a(+)质粒，通过T4DNA连接酶将目的基因片段分别连接入表达载体中，转化入DH5a，构建重组表达质粒：pET-32a／OMPl0、pET-32a／OMPl6、pET-

5、32a／OMPl9。经双酶切和测序鉴定后，分别将三个重组表达质粒转化入E．coliBL21(DE3)。经终浓度为lmM／LIPTG诱导表达，SDS．PAGE、Western．blot鉴定和可溶性分析后，发现重组蛋白pET-32a／OMPl0、pET-32a／OMPl6、pET-32a／OMPl9为包涵体形式，采用Ni-NTASpinKit分别纯化重组蛋白。用纯化后的pET-32a／OMPl0与弗氏完全佐剂和不完全弗氏佐剂等布鲁氏菌三个外膜脂蛋白的原核表达、纯化及免疫原性实验体积乳化后，采用背部皮下多点注射方式免

6、疫4—6周龄小鼠。共免疫三次，每次间隔2周，于第3次免疫后7天进行心脏采血。然后用4"C离心机5000rpm／min，离心10mm，获得抗血清。再以抗血清为一抗WestemBlot分析，观测重组蛋白的免疫原性。结果本实验成功构建了含有三个脂蛋白基因的克隆载体和表达载体。经多次对表达条件的优化后，大量表达并纯化了三个重组融合蛋白，获得了较高纯度的重组蛋白，为进一步研究蛋白的免疫原性和抗感染免疫功能奠定了基础。然后将纯化的包涵体蛋白pET-32a／OMPl0与弗氏佐剂乳化后，免疫昆明小鼠，获得抗血清，并做了免疫原性

7、实验，证明OMPIO蛋白具有较好的免疫原性，为进一步研究布鲁氏菌外膜脂蛋白的功能和新型亚单位疫苗的候选蛋白的筛选奠定了基础。关键词：布鲁氏菌；外膜脂蛋白；表达；纯化；免疫原性山东农业大学硕士学位论文AbstractBrucellosisisazoonoticdiseasewhichcausedbytheBrucella,anditisseriousharmtothedevelopmentofanimalhusb岫andhumanhealth．Brucellosisisaworldwidepublichealth

8、probleminmorethan170countriesaroundtheworld．Inrecentyears，themonitoringresultsshowedthatbrucellosiswasmoreandmoreseriousinChina．SheepandcattlebrucellosisinfectionratesroseSOfastthatitbecameoneof