布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)的制备及免疫原性评价.pdf

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1、分类号:密级:公开学号:2015200544单位代码:10759石河子大学硕士学位论文布鲁氏菌外膜囊泡（OMVs）的制备及免疫原性评价学位申请人徐锦凤指导教师陈创夫教授申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称生物化学与分子生物学研究方向动物基因工程所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2018年6月EvaluationandapplicationofimmunogenicityofBrucellaoutermembranevesicles(OMVs)ADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequi

2、rementsfortheDegreeofNaturalScienceByXuJinfeng（BiochemistryandMolecularBiology）DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuJune,2018石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明课题来源国家重点研发计划项目名称:《病原菌感染与入侵的分子机制》项目编号:2017YFD0500304学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要

3、贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名:时间:年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。究生签名:时间:年月日导师签名:中文摘要布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患病，可造成家畜的流产甚至人类波状热、关节炎、脑膜炎等。目前动物布鲁氏菌疫苗主要为弱毒疫苗，但这类疫苗存在毒力较强容易导致流产且保护力较

4、低的缺点。鉴于脑膜炎奈瑟菌外膜囊泡（OMVs）疫苗的成功研制，本项目对布鲁氏菌OMVs的制备方法进行探索，并在小鼠模型上对OMVs及其组分的免疫原性和免疫保护性进行评价，为布鲁氏菌新型亚单位疫苗的研究奠定了基础。目的：（1）以羊种布鲁氏菌新疆流行株043为研究对象，对提取的OMVs的形态和组分进行鉴定，探究其对巨噬细胞细胞因子表达和粘附内化的影响。（2）建立与OMVs相关的外膜总蛋白（OMP）、重组外膜蛋白和脂多糖核心蛋白血清学评价方法，筛选获得具有较强特异性和反应原性的蛋白。（3）分析布鲁氏菌外膜囊泡及其相关蛋白的免疫原性及免疫保护作用。方法：（1）通过超高速离心提取OMVs，使用透射

5、电镜观察其形态和大小，利用SDS-PAGE鉴定OMVs的蛋白组成，通过RT-PCR检测OMVs刺激小鼠巨噬细胞后细胞因子的表达，并通过CFU计数评价其对细胞粘附内化的影响。（2）对OMP进行提取并表达和纯化BP26、OMP10、GMD、ManB蛋白，通过WesternBlot验证其反应原性，通过间接ELISA筛选特异性和反应原性高的优势蛋白。（3）分别使用弗氏佐剂和纳米佐剂（LDH）乳化OMVs、OMP、BP26、OMP10及BP26+OMP10双抗原免疫小鼠，通过间接ELISA检测其特异性抗体水平，通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚型以及通过ELISA检测IFN-γ和IL-4的表达水平评价

6、其细胞免疫水平。小鼠加强免疫14天后使用布鲁氏菌M5株以2×106CFU进行攻毒实验，攻毒15天后进行组织病理学观察和脾脏载菌量的检测，评价其免疫保护力。结果：（1）布鲁氏菌043OMVs大小在20-200nm之间，平均60.5nm，其蛋白组成主要为22、29、51KD左右；OMVs可显著性诱导小鼠巨噬细胞产生的IFN-γ、IL-6、IL-12、TNF-α和IL-10基因的转录表达，且IFN-γ、IL-6表现为早期表达。且OMVs可显著增强细胞对布鲁氏菌的粘附和内化作用。（2）成功获得了布鲁氏菌OMP和BP26、OMP10、GMD、ManB蛋白，通过方阵滴定法建立了不同抗原的最佳ELIS

7、A反应条件，并筛选得到了反应原性较好的布鲁氏菌OMVs、OMP、BP26、OMP10。（3）免疫实验结果显示:实验动物可产生特异性抗体，且在初次21天时达到最高水平，复免后抗体明显升高。弗氏佐剂和纳米佐剂免疫组的脾脏淋巴细胞中均可检测到高水平的IFN-γ，但IL-4的水平与PBS组无显著差异，表明OMVs和及其相关蛋白均可诱导较强的Th1型免疫应答。淋巴细胞亚群检测结果显示:各组抗原均能诱导非特异性T淋巴细胞增殖作用，而相对于OMP