蛋白质的原核生物表达与纯化实验大纲

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1、实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆一．实验目的通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法二．实验原理基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。三．实验用品１.　材料：EV71病毒基因组序列载体pMAL-c2x（Amp抗性）大肠杆菌DH5a２.　器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平３.　试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂

2、解液、电泳缓冲液、RnaseA、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、1kb分子量DNAMarker、内切酶BamHI和SalI、DNA片段胶回收试剂盒、X-gal贮液、IPTG贮液、Tris碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖四．方法与步骤（一）缓冲液及培养基配制1.质粒提取试剂：溶液I：葡萄糖50mmol/L,Tris-HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L于6.895×104Pa灭菌15min，4℃保存。溶液

3、II：NaOH0.2mol/L，SDS1%。SDS（10%，200ml）：20gSDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200ml。溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pHTE缓冲液：1mlTris-HCl(1MpH8.0),0.2mlEDTA(0.5MpH8.0),加灭菌水至100ml。2.LB液体培养基（perliter）:胰蛋白胨10g酵母膏5gpH7.0NaCl5g(二).步骤1．碱裂解法抽提质粒实验原理：在pH12.0～12.6碱性环境中，细菌的染色体DNA变性分开，而共价

4、闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。步骤：1）接种一单菌落于5ml液体培养基中，加适量抗菌素，37℃摇床培养过夜；2）取1.5ml(制备低拷贝质粒取5ml),12000r/min,离心1min（菌较多时可富集）；3)吸尽上清液，悬浮菌体于200ul预冷的溶

5、液I中；4）加入溶液II，400uL,用手颠倒7-8次，至菌液完全清亮，并有拉丝现象比较粘稠；5)加入溶液III，300uL，用手颠倒7-8次；6）离心（12000/min）10min；将上清转入新的EP管中；7)离心（12000/min）10min，将上清转入新的EP管中，弃去沉淀；9)加入异丙醇（1倍体积）750uL，颠倒几次混匀；放置5min；10)离心（12000/min）10min，弃去上清；11)加入70%乙醇500uL，放置2min；12)离心（12000/min）2min；弃尽上清；13)37℃放置10min（培养

6、箱）干燥；14）加入50uLTE或者灭菌的超纯水融解DNA。15）质粒检测完毕后，置于-20℃保存附注：质粒检测      电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型       吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。2．EV71非结构基因2b引物设计：F15‘cgggatccagcgcttcctgg3’BamHI（上游）F25‘g

7、cgtcgacttattggaatagag’SalI（下游）3.目的片段EV712B基因PCR扩增和纯化；实验原理：PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。实验步骤：1.按下列体系配制反应混合液：TemplateDNA              0.5μl（20ng）   10×buffer             2μl   PrimerF(50μM)  

8、         0.5μl   PrimerR(50μM)         0.5μl   dNTPs（10mM）           0.5μl   Taq（5U/μl）          0.5μl   AddddH2O to