hiv-1nc蛋白表达纯化及免疫原性初步地研究

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1、摘要人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的核壳体蛋白(NC)含有两个高度保守的锌指结构(CCHC型)，而它)乙在HIV-1生活周期的多个阶段多个步骤中都起到非常关键的作用，因此核壳体蛋白成为近年来抗HIV药物研究的热点之一，但是出于HIV高度的遗传变异性和抗HIv药物的高毒副作用及高昂的价格，HIV口服疫苗在控制HIv感染和艾滋病流行中的重要生物医学干预作用便由此凸显出来。本实验课题是从pNL4．3质粒经PcR得到HIV-1NC的编码序列，然后克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)才H应的酶切位

2、点中，成功构建了重组pET-28a(+)原核表达载体。将此重组质粒转化E．coliBL21(DE3)，经IPTG诱导表达并经Westernblotting鉴定成功表达后，裂解菌体，进行纯化。重组蛋白存在于上清中，首先采用Ni柱亲和层析初步纯化，超滤浓缩后通过凝胶过滤层析进一步纯化，收集并浓缩重组蛋白，免疫新西兰雄兔，自制多克隆抗体并利用抗原亲和层析纯化多克隆抗体。另一方面，首先利用杆状病毒载体pFastBacl作为供体质粒，将HIV-1NC的编码序列转座至SJBacmid上，构建重组Bacmid．

3、nc。脂质体转染家蚕BmN细胞得到重组病毒后，通过荧光定量PCR钡,U定了重组病毒的滴度，用扩增后的重组病毒感染家蚕细胞，以自制并纯化的多克隆抗体为一抗，Westernblotting鉴定目的蛋白NC在家蚕细胞中已成功表达，并自制抗体亲和纯化柱从细胞中进行了目的蛋白的纯化。最后，用重组病毒分别大量接种家蚕五龄幼虫和蛹，Westernblotting鉴定NC在家蚕幼虫及蛹中也得到成功的表达。发病蚕蛹和正常蚕蛹分别经匀浆、过滤、离心、超滤、冻干后，研究小鼠口服免疫效果。实验组包括原核免疫组(原核表达的

4、重组蛋白+正常蚕蛹粉)和真核免疫组(表达NC的发病蚕蛹粉)，对照组包括0．9％生理盐水组和正常蚕蛹粉组。最终用间接ELISA检：狈0小鼠血清抗NC特异性抗体的反应情况。本研究在利用家蚕杆状病毒表达系统成功表达HIV-1NC抗原蛋白的基础上，初步探讨了蚕蛹中表达的HIV-1NC及其原核表达的重组蛋白对小鼠的口服免疫原性，为利用家蚕杆状病毒表达系统低成本研发以HIV-1NC为免疫原的HIV口服疫苗提供了依据。关键词：HIV．1，核壳体蛋白，表达，家蚕杆状病毒表达系统，口服免疫原性Abstract--_

5、____—________●_-●____●___-_—●‘_______-_-_-一____一__————--__●__—_-__-____-_-_-●-______-_-_——-______-’—______’____-__-_______-_________-—●-__-一TheHIV-1nucleocapsidprotein(NC)containstwohighlyconservativeCCHC·typezincknuckledLomainsandplaysanveryimportant

6、roleinseveralstagesofthelifecycleofHIV-1，whichmakesnucleocapsidproteinaresearchinghotspotofanti-HIVdrugsinrecentyears．OwingtothegreatgeneticvariabilityofHIVandthehightoxityandsideeffectsofexpensiveanti．HIVdrugs．theroleofbiomedicalinterventionofanewHIV

7、oralvaccineishighlighted．Inthisstudy,thecodingsequenceofNCwasamplifiedfrompNL4．3byPCR，andthenclonedintotheEcoliexpressionvectorpET-28a(+)．Therecombinantplasmidwastransformedinto．E．coliBL21(DE3)andafterthesuccessfulexpressioninducedbyIPTC{thebacteriawa

8、slysedtopurifytheprotein．TherecombinantproteinwhichexsitedinsupematantwasfirstlypurifiedviaNi．NTAaffinitychromatographyandconcentratedbyultrafiltration；thenfurtherpurifiedthroughsizeexclusion．Afterultrafiltration，thepolyclonalantibodywasprepar