基于hand系统的腹泻病原体多重pcr检测方法的建立和应用研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文基于HAND系统的腹泻病原体多重PCR检测方法的建立和应用研究EstablishmentandapplicationofHANDsystem—basedmultiplexPCRassaysforthedetectionofdiarrheapathogens课题来源：国家传染病科技重大专项一“传染病监测技术平台”子项目(2009ZXl0602．02)珠海检验检疫局科技计划项目(ZH2009-4)、(ZH2013．1)学位申请人滕勇勇导师姓名阿蚓副教授、莫秋华副主任技师专业名称流行病与卫生统计学

2、培养类型专业型培养层次硕士研究生所在学院公共卫生与热带医学学院答辩委员会主席陈维清教授答辩委员会委员柯昌文主任技师曾年华研究员陈青山教授陈清教授2014年5月28日广州悼念我的研究生导师一孙虹老师山川含泪，草木皆悲，惊闻噩耗，悲痛万分，惋惜至极!孙虹老师知识渊博、治学严谨，与老师学术交流时，常常使学生醍醐灌顶，如坐春风!孙虹老师平易近人、和蔼可亲，时常保持灿烂的笑容和亲切的话语，对学生的生活和学习关心备至!孙虹老师爱岗敬业，恪尽职守，勤勤恳恳，在平凡的岗位默默地奉献着，为珠海口岸的卫生事业做出了突出的贡献!孙虹老师虽然走了，

3、但她那种严谨的学术态度，为人师表的风范，爱岗敬业、无私奉献的精神将永远铭记在学生心中，并以此为学习楷模!我一介晚辈，能作为老师的学生，实乃大幸，仅以此缅怀老师，以表哀思，愿孙虹老师一路走好!硕士学位论文基于HAND系统的腹泻病原体多重PCR检测方法的建立和应用研究硕士研究生：滕勇勇指导教师：匦鲴副教授莫秋华副主任技师摘要研究背景和目的急性感染性腹泻(简称腹泻)一直是危害人类健康特别是婴幼儿健康的常见病和多发病，是全球范围内影响儿童和成人的重要公共卫生问题。引起腹泻的病原体主要是病毒和细菌，但具体种类繁多，且常常伴有多种腹泻病

4、原体复合感染的情况，在实际检测中往往需要从这一系列的怀疑对象中确定腹泻病原体，为腹泻病的快速诊断带来了极大的困扰。因此，建立一种高通量、高效的腹泻病原体快速检测技术对于诊断、控制和及时治疗腹泻病具有重要意义。然而，国内外对腹泻病原体实验室检测还很大程度依赖传统分离培养和生化鉴定，但是分离培养和生化鉴定敏感性低、费时费力，需要一周左右才能完成，难以达到暴发流行时快速检测的要求，而且有的病原体(如诺如病毒)目前还没有合适的细胞体系和动物模型进行培养。一些免疫学方法(如酶联免疫吸附试验)也被广泛的应用到腹泻病原体的检测，但其敏感性

5、低，假阴性率高，容易造成漏检，而且对于细菌来说需要预先将样本中的目标菌进行浓缩和纯化，短时间内也很难得到结果，难以达到快速检测的要求。随着分子生物学检测方法的发展，基于腹泻病原体的分子生物学诊断技术如PCR、RT-PCR、Real—TimePCR、LAMP等在腹泻病原体的检测以及腹泻病诊断方面发挥着重大作用，克服了以T摘要上的缺点，特异性和敏感性较高，己成为目前腹泻病原体快速诊断的常规手段，但这些方法一次只能检测一种病原体，达不到高通量的检测要求，对于复合感染的病例也容易漏检，而且Real。TimePCR仪器费用昂贵，检测成

6、本较高，操作复杂，不利于在基层实验室推广。基因芯片技术虽然具有高通量的特点，但也存在技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度低且重复性差等难以解决的问题。多重PCR是一种相对省时、省力方法，可以在一个反应体系中同时检测多个病原体，具有高通量、低成本的特点，但由于多重PCR是多种不同引物混合，容易形成引物问的相互干扰和引物二聚体，使得反应体系扩增效率不均衡，稳定性差，而基于HAND系统多重PCR可以有效的解决这些问题。相同标签辅助．无引物二聚体一(Homo—TagAssistedNon-Dimer，HAND)系统，亦称同源加尾系统，是1

7、997年Browine为了消除PCR中引物二聚体的产生而设计的实验方法。该系统采用两种引物，即加尾引物(3’端为特异性结合序列，5’端为添加的通用尾巴序列)和尾巴引物(序列与加尾引物5’端添加的通用尾巴相同)。其基本原理首先是低浓度的加尾引物与模板特异性结合，扩增形成两端均含有尾巴引物相同序列的初始PCR产物：此时若加尾引物之间形成引物二聚体，由于两端存在互补的序列，引物二聚体的单链会各自形成一个稳定的发夹结构，而该结构难以成为下一循环的扩增模板，从而大大的减少了引物二聚体的形成；其次是待低浓度的加尾引物消耗完，高浓度的尾巴

8、引物以初始PCR产物为模板进行特异性结合，直至扩增完成。所以将HAND系统与多重PCR结合的优点是可以有效地抑制引物二聚体的产生，提高多重PCR体系引物的容纳数量，减小各基因扩增效率的差异，使扩增均衡高效和稳定。因此，本研究第一部分拟构建针对常见腹泻病毒、肠道致病菌、致病性弧茵三组腹泻病原