9种猪病病原体gexp多重pcr检测方法的研究

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1、分类号：密级：论文编号：学号：50121002501重庆理工大学硕士学位论文9种猪病病原体GeXP多重PCR检测方法的研究研究生:陈玉燕指导教师：蔡家利教授李应国研究员（重庆出入境检验检疫局）学科专业：微生物与生化药学研究方向：疫苗与诊断技术培养单位：药学与生物工程学院论文完成时间：2015年3月25日论文答辩日期：2015年5月28日CategoryNumber：LevelofSecrecy：SerialNumber：StudentNumber：50121007501Master'sDissertationofChongqingUniversityofTechnologyAN

2、ovelGeXPMultiplexPCRMethodfortheSimultaneousDetectionofNineSwinePathogensPostgraduate:ChenYuyanSupervisor：ProfessorCaiJialiResearcherLiYingguo(CQCIQ)Specialty:MicrobialandBiochemicalPharmacyResearchDirection:VaccineandDiagnosticTechniqueTrainingUnit:SchoolofPharmacyandBioengineeringThesisDea

3、dline:March25,2015OralDefenseDate:June28,2015重庆理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研宂所取得的成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果、作品。对本文的研究做出重要贡献的集体和个人，均己在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律后果。作者签名学位论文使用授权声明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权重庆理工大学可以将本学位论文的全

4、部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于（请在以下相应方框内打“士)：1.保密□，在年解密后适用本授权书。2.不保密口。作者签名:曰期：wli年6月3导师签名:日期>106月/7摘要9种猪病病原体GeXP多重PCR检测方法的研究摘要猪圆环病毒二型、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、水疱性口炎病毒、猪水泡病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌以及猪胸膜肺炎放线杆菌等都是临床上较为常见的，传染性强、流行广泛，且危害极为严重的猪病病原体，极大的影响并制约着我国的生猪养殖行业的发展，也对社会公共卫生安全造成了巨大的隐

5、患。这9种疫病常以混合感染的形式出现，临床症状十分复杂，目前的检测手段难以应对。GenomeLabTMGeXP遗传分析系统是一种新型的多基因表达定量分析平台，将GeXP的多重PCR扩增技术与毛细管电泳分析技术相结合，利用带有荧光标记的通用引物和特异性嵌合引物的联合扩增，使目的基因得到高效表达，该技术具有特异性强、灵敏度高、高通量及检测速度快等优点。本研究根据NCBI公布的PCV-2、CSFV、PRRSV、VSV、SVDV、TGE、M.hyo、HPS以及APP的靶基因序列，对保守区基因序列进行分析比对，并设计9对特异性引物，利用常规PCR的单引物单模板和单引物混合模板的双重验证方

6、式，对以上引物进行特异性验证分析；同时利用高效的pMD19-TSimple克隆载体构建9种阳性克隆质粒，应用GeXP技术进行测序分析。结果显示，所设计的引物均具有良好的特异性和敏感性，阳性克隆质粒测序结果均与GenBank所中公布靶基因序列相符，同源性达到99.5%以上。将9对特异性引物其进行优化和修饰，设计出两组GeXP引物：一对加有cy5荧光标记的通用引物和9对特异性嵌合引物，并建立单重GeXP体系、初步构建多重GeXP体系、对多重体系的特异性引物Tm值及特异性引物的含量进行优化，并验证其特异性及灵敏度。结果显示，单重GeXP体系灵敏度可达102copies/µL，灵敏度与

7、Lamp相当，是荧光定量PCR的1000多倍；多重GeXP体系优化结果显示，最优Tm值为58.5℃，最佳特异性引物含量为上下游各0.5µL，在该反应条件下体系对于目的片段的扩增更加的清晰、特异、更易于的判断，同时提高了该体系扩增的稳定性。对其他12种常见畜病病原体的进行特异性验证时，均未发现非特异性扩增，从而进一步证明该多重GeXP体系具有极高特异性；对27份临床样本进行检测，结果显示阳性率为40.7%，与实际的结果相符，证明了该多重GeXP体系具有高准确性及较强的临床实用价值。关键词：Ge