应用多重pcr方法鉴定rhd基因型的研究

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1、应用多重PCR方法鉴定RHD基因型的研究作者：徐华，叶世辉，王宝燕，刘孟黎，吴大洲，贺晨【摘要】目的建立一种可靠的PCR方法，用于RHD血型基因型的研究。方法根据RHD血型基因的特点，设计针对不同RHD基因型的特异性引物，建立多重PCR方法，并与商用试剂盒进行对比。结果本研究所建立的用于鉴定RHD血型基因型的多重PCR方法，与商用试剂盒具有相同的试验结果。结论本研究建立的多重PCR方法具有简便、准确和经济的特点，可以用于RHD基因分型。【关键词】多重PCR;RHD血型基因型;RHD基因分型;DEL血型　　ABSTRACT:ObjectiveToestablishareliablePCRm

2、ethodforRHDgenotypesresearch.MethodsBasedonthecharacteristicsofRHDgene,thespecificprimersweredesignedfordifferentRHDgenotypestoestablishthemultiplexPCRandcompareitwithcommerciallysuppliedRHDgenotypingkit.　ResultsThemultiplexPCRutilizedforRHDgenotypeswasestablished.TheresultsofRHDgenotypeswerethes

3、amebetweenthemultiplexPCRmethodandcommerciallysuppliedkit.ConclusionThemethodofthemultiplexPCRcanbeutilizedforthestudyofRHDgenotypesbecauseitisconvenient,accurateandeconomical.9　　KEYWORDS:multiplexPCR;RHDgenotype;RHDgenotyping;DELbloodgroup　　近年来，研究发现一些血清学初检RHD阴性的个体经过进一步的检验，可以检出D抗原和D基因。通过进一步的研究，又可

4、以分为部分D(partrial-D)和弱表现型D(weak-D)两种类型;这些特殊RHD血型的发现，对更加科学地指导安全输血工作和新生儿溶血病的实验诊断，都有非常重要的意义[1]。目前，RHD血型的鉴定主要依赖于血清学实验。但是，血清学的方法很难检出一些特殊的RHD血型;应用分子生物学的方法鉴定RHD血型具有鉴定准确，可以发现一些特殊的RHD血型，但市售RHD基因分型试剂盒存在价格昂贵、操作复杂等缺点。为了提供一种经济、简便和直观的分子生物学方法，我们开展了多重PCR方法鉴定RHD血型基因型的研究。　　1材料与方法　　1.1材料DNA标本取自西安市无偿献血者EDTA抗凝全血样本，经血检科

5、初步筛选分为RhD阳性和RhD阴性，用Promega全血DNA提取试剂盒提取基因组DNA，DNA浓度为50～150mg/L，-20℃冻存备用;标准质控对照为德国INNO-TRAIN公司出品，分别为D/d型和d/d型样本。9　　1.2多重PCR的引物设计多重PCR引物是利用人类不同的RHD基因型的特异性序列位点的改变，设计多对引物，其中引物对①的　　DEL-f1和DEL-r1分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，DEL-f1最末碱基针对DEL血型1227位发生G>A的突变而设计[2-3]，DEL-r1位于第9、10外显子之间的内含子中，扩增片断长度为102bp;引物

6、对②的Dc-f1和Dc-r1分别为扩增位于RHD和RHCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp;引物对③的RhD-f1和RhD-r1分别为特异性扩增位于第10外显子的RHD基因的上下游引物，其中RhD-f1位于第9、10外显子之间的内含子中，无序列特异性，RhD-r1位于RHD基因第10外显子中，与同位置RHCE基因有11个碱基差异，具有序列特异性，扩增片断长度为261bp;引物对④的Dneg-f1和Dneg-r1分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，其中Dneg-f1位于上游Rh盒子基因内，在下游Rh盒子基因无相同序列，Dneg-r1位于下游R

7、h盒子基因内，在上游Rh盒子基因无相同序列，扩增片断长度为1921bp(图1、表1)。图1RHD基因型检测引物设计原理图Fig.1TheprincipleofprimerdesigningforRHDgenotyping表1RHD基因型检测引物序列9　　1.3PCR反应条件PCR仪为PE9700(美国，AB公司);Taq酶购自上海PROMEGA公司;dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司;在100μL的Ependoff管内加入12.8