SNT1586.3-2011 菜豆的多重PCR鉴定方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１５８６．３—２０１１菜豆的多重犘犆犚鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊犫狔犿狌犾狋犻狆犾犲犘犆犚２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１５８６．３—２０１１前言ＳＮ／Ｔ１５８６系列标准共分为三部分：———第１部分：菜豆细菌性萎蔫病菌检测方法；———第２部分：菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法；———第３部分：菜豆的多重

2、ＰＣＲ鉴定方法。本部分为ＳＮ／Ｔ１５８６的第３部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本部分主要起草人：许瑾、徐涛、梁成珠、岳志芹、郑小龙、吴志毅、张舒亚、陈洪俊。Ⅰ版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１５８６．３—２０１１菜豆的多重犘犆犚鉴定方法１范围ＳＮ／Ｔ１５８６的本部分规定了对菜豆遗传种质资源

3、多重ＰＣＲ鉴定方法。本部分适用于菜豆物种及其遗传材料的检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＡＳＴＭＥ１３４２用冷冻、冷冻干燥和低温养护法保存细菌、真菌、原生生物、病毒、遗传要素以及动物和植物组织的标准实施规范３术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１荚果犾犲犵狌犿犲豆科植物特有的果实。由单个心皮发育而成的果实。一室内含２

4、个或２个以上的种子，成熟后果皮沿两侧自下而上裂开。３．２子房狅狏犪狉狔被子植物生长种子的器官，位于花的雌蕊下面，一般略为膨大。子房里面有胚珠，胚珠受精后可以发育为种子。是被子植物花中雌蕊的主要组成部分，子房由于房壁和胚珠组成。当传粉受精后，子房发育成果实。子房壁最后发育成果皮，包裹种子，有的种类形成果肉，如桃、苹果等。３．３花萼犮犪犾狔狓位于花冠外面的绿色被片，它在花朵尚未开放时，起着保护花蕾的作用。是一朵花中所有萼片（ｓｅｐａｌ）的总称，包被在花的最外层。萼片多为绿色而相对较厚的叶状体。萼片彼此分离的叫离

5、萼，萼片彼此合生的叫合萼，合萼下端称萼筒，上端分离部分称萼裂片；两轮萼裂片的外轮称副萼。３．４萼齿犮犪犾狔狓狋狅狅狋犺合生萼片的分离部分。３．５花冠犮犺犪狆犾犲狋一朵花中所有花瓣的总称，位于花萼的内侧。３．６花柱狊狋狔犾犲雌蕊中连接柱头与子房的部分。一般为细长管状，也有极短的，如水稻、小麦。花柱是花粉进入子１版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１５８６．３—２０１１房的通道。３．７复叶犮狅犿狆狅狌狀犱犾犲犪犳两至多枚分离的小叶，共同着生在一个叶柄上，称为复叶。４原理菜豆植物资源进出境时，可能存在的形态有：种

6、子、幼苗、植株、叶片、花序、花粉、组培苗、原生质体、组织、细胞、核酸等。以多重ＰＣＲ方法为主，并借助形态学特征是制订本标准的主要依据。５仪器设备和用具５．１ＰＣＲ扩增仪。５．２电泳仪。５．３凝胶成像仪。５．４核酸蛋白分析仪。５．５离心机。５．６水浴锅。５．７植物光照培养箱。５．８低温冰箱。５．９冷冻冷藏冰箱。５．１０电子天平。５．１１水浴锅。５．１２小型粉碎装置。５．１３涡旋振荡器。５．１４可调移液器（１０００μＬ、２００μＬ、１００μＬ、２０μＬ、１０μＬ、２．５μＬ）、可调移液器头、离心管、研钵等。６试

7、剂及溶液６．１样品提取缓冲液：１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５），１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠，５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），２％ＳＤＳ。６．２试验用水：按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定。６．３ＲＮＡ消化酶。６．４ＥＤＴＡ（０．５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．０）：在８００ｍＬ水中加入１８６．１ｇＥＤＴＡＮａ２·２Ｈ２Ｏ，用磁力搅拌器剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液ｐＨ值至８．０（约需２０ｇ氢氧化钠颗粒），然后加水定容至１Ｌ，分装后高压灭菌备用。６．５１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液（ｐＨ８．０）：称取１

8、２１．１ｇＴｒｉｓ，溶于８００ｍＬ水中，加入浓盐酸４２ｍＬ，冷却至室温，用稀盐酸准确调节ｐＨ至８．０，加水定容至１Ｌ，分装后高压灭菌备用。６．６ＴＥ（ｐＨ８．０）：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。６．７１０×Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（电泳上样缓冲液）。６．８ＤＮＡＭａｒｋｅｒ。６．９琼脂糖。６．１０植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒。２版权所有·禁止翻制、电子发售犛