多重 pcr 检测耐万古霉素肠球菌的基因型研究

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1、多重PCR检测耐万古霉素肠球菌的基因型研究【摘要】目的：研究7株耐万古霉素肠球菌（VRE）耐药表型和基因型，指导临床合理使用抗生素。方法：采用琼脂筛选法筛选VRE，并分别用Etest、多重PCR和限制性长度多态性分析方法检测万古霉素耐药或中介肠球菌株的表型和基因型。结果：7株对万古霉素耐药或中介的肠球菌株，2株为vanA型，3株为vanC1型，1株为vanC2/3型，1株基因型未明，基因型和表型一致。结论：7株VRE中有2株vanA型，提示实验室准确检测VRE对临床上合理使用抗生素和预防VRE的流行是非常重要的。【关键词】万古霉素；

2、耐药性；肠球菌；表型；基因型〔Abstract〕ObjectiveVanycinresistancephenotypesandgenotypesediateenterococciultiplexPCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism.Results7strainsediatetoenterococci,vanAfor2strainsedtothegenotypes.Conclusion2strainsvanAhavefound.Itisimportantforclinicallaborat

3、orytodetectVREethodstoinstructrationalapplicationofantibioticsclinicallyandpreventVREprevalence.〔Key-H琼脂、脑心浸液培养基购自Oxoid公司；Taq酶及dNTPs等购自上海英俊公司；引物：vanA，vanB，vanC1和vanC23由上英俊公司合成。引物序列vanA：P1:5，-CATGACATATCGGTAAAATC-3，P2:5，-CATGACATATCGGTAAAATC-3，（885bp）；vanB：P1:5，-CATGATG

4、TGTCGGTAAAATC-3，P2:5，-ACCGGGCAGRGTATTGAC-3，（885bp）；vanC1：P1:5，-GATGGCAGTATCCAAGGA-3，P2：5，-GTGATCGTGGCGCTG-3，（467bp）；vanC2/C3：P1:5，-GATGGCAGTATCCAAGGA-3，P2:5，-ATCGAAAAAGCCGTCTAC-3，（429bp）[2]。1.4主要实验仪器VITEK-32AMS微生物鉴定系统，生物梅里埃公司；DNA扩增仪，MJ公司；GeneGENIUS全自动凝胶图像分析系统，SYNGENE公司

5、。1.5菌株鉴定用VITEK-32AMS微生物鉴定系统和GPI鉴定卡鉴定肠球菌。1.6药敏试验（纸片扩散法和Etest）按美国临床实验室标准化委员会2004年版操作和判断结果。1.7细菌DNA提取将细菌接种在普通营养琼脂（LB）液体培养基中，35℃过夜。取1.5mL菌液倒入eppendorf管中，12000r/min离心5min，去上清，用80LDNA提取液将细菌重悬，混匀，100℃水浴20min后，取出并迅速置于冰上，放置10min，10000rpm/min离心1min，上清即为模板。1.8多重聚合酶链反应（PCR）反应体积50L

6、，含引物混合液8L〔取vanA-FOR（10pmol/L），vanB-FOR（10pmol/L），vanC1-REV（10pmol/L），vanC23-REV（10pmol/L）各20L；vanAB-REV（10pmol/L），vanC123-FOR（10pmol/L）各40L于1.5mL离心管中充分混合〕，dNTPs2L，模板3L，Taq酶1.25U。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃45s，50℃45s，72℃2min共30个循环，最后1个循环后72℃延伸7min，扩增产物加入1%的琼脂糖凝胶，电泳后在全自动凝胶图像分

7、析系统下照相观察。1.9限制性内切酶酶切对阳性片段用MspI酶切鉴定分型，酶切体系20L，其中2L内切酶缓冲液、2LBSA、1LMspI、5L无菌水和10LPCR产物，将样本置于37℃水浴中酶切1h。产物加入3%的琼脂糖凝胶，电泳后在全自动凝胶图像分析系统下照相观察。2结果2.1肠球菌耐万古霉素琼脂筛选结果7株VRE均在含6L/mL万古霉素的BHI筛选平板上生长，其中1株为粪肠球菌，2株为屎肠球菌，3株为鹑鸡肠球菌，1株为铅黄肠球菌。2.2Etest结果对3株筛选出的肠球菌和4株天然耐药肠球菌（3株鹑鸡肠球菌和1株铅黄肠球菌），用E

8、test测定其对万古霉素和替考拉宁的最小抑菌浓度（MIC），见表1。2.3基因检测结果7株VRE用多重PCR和限制性内切酶酶切方法进行耐药基因检测，结果2株为vanA型，3株为vanC1型，1株为vanC2/3型，1株基因型未明。3讨