水牛精液蛋白质组学的相关研究

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1、广西大学硕士学位论文水牛精液蛋白质组学的相关研究姓名：杨丽申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：张明201206水牛精液蛋白质组学的相关研究摘要精液与雄性生殖疾病密切相关，近年来，蛋白质组学的出现为精液研究提供了新的有效的研究方法。迄今为止，蛋白质组学已运用在人、鼠等多种动物的精液研究中，促进了精子发生分子机理的认识和雄性生殖疾病治疗。本研究主要在实验室前期研究的基础上，对水牛精液进行更为深入的研究，进一步优化水牛精液蛋白质组学体系，为后续的差异蛋白质组学提供良好的技术支撑。此外，分离鉴定高、低活力水牛精子之间以及高

2、畸形率、正常精子之间的表达差异蛋白，为理解活力低下、形态异常的机制奠定理论基础。第一章：通过比较PG胶条的长度、线性或非线性、上样量、SDS．PAGE胶浓度、纯化蛋白的方法等参数，优化水牛精子蛋白双向电泳蛋白质组学体系。试验结果显示，用丙酮沉淀法纯化蛋白，．上样量350lag，并使用24cmpH3．10NLIPG胶条，浓度12．5％的SDS—PAGE胶进行双向电泳，能获得了分辨率高、质量更好的含有约500多个蛋白点的水牛精子蛋白2一DE图谱。第二章：运用己优化的双向电泳技术体系分离高、低活力水牛精子蛋白，使用ImageMaster

3、2．0软件比较分析两者2-DE图谱，并结合基质辅助激光解吸附电离一飞行时间质谱(MALDI—TOF．MS)和生物信息学鉴定差异蛋白点。本章试验建立了高、低活力的水牛精子差异蛋白表达的2-DE图谱，并筛选得到18个差异蛋白点，其中有5个蛋白点在低活力的水牛精子中表达下调，8个表达上调，1个缺失，4个在高活力水牛精子中缺失。最终，质谱成功鉴定了其中4个，分别对应3种蛋白：精子尾部结构蛋白2、a—ATP合成酶、Q．琥珀酰辅酶A合成酶。精子尾部结构蛋白2、Q—ATP合成酶在低活力精子中表达下调，d一琥珀酰辅酶A合成酶表达上调，这些差异点可

4、能与精子活力相关。第三章与第二章的试验方法一致。本章试验建立了高畸形率、正常水牛精子蛋白双向电泳差异蛋白表达谱，并筛选得到16个表达差异明显的蛋白点，其中5个蛋白点在畸形率高的水牛精子中表达量上调，6个表达量下调，3个缺失，2个在正常水牛精子中缺失。并运用质谱成功鉴定了6个，分别对应4种蛋白：左旋天冬酰胺酶、热应激蛋白、半乳糖激酶、13一微管蛋白。左旋天冬酰胺酶、热应激蛋白、半乳糖激酶在畸形率高的水牛精子上表达量上调，13．微管蛋白表达量则下降。这些差异点与精子结构、代谢等有关，可能与精子形态结构异常相关联。第四章试验主要通过对比

5、不同上样量，进一步优化水牛精浆双向电泳体系，并使用质谱技术鉴定部分水牛精浆蛋白。结果表明，3001．tg的上样量优于200lxg和300pg，使用300llg上样量于非线性的24cmpH3一lO的IPG胶条，获得了蛋白点500多个的水牛精浆2-DE图谱。质谱鉴定103个丰度相对较高的水牛精浆蛋白点，最终27个被成功鉴定，分别对应15种蛋白：血清白蛋白、血清转铁蛋白、T_复合蛋白1．13、磷酸甘油酸激酶、山梨醇脱氢酶、果糖一1，6．二磷酸酶、肌动蛋白、锌Ⅱ2糖蛋白、过敏原Bosd2、牛精清蛋1刍-30kDa、过氧化还原酶．5、附睾分

6、泌蛋白E1、溶菌酶c一3、核糖核酸酶、磷酸变位酶。综上所述，本研究进一步优化了水牛精子和精浆蛋白双向电泳技术体系，为差异蛋白质组学研究奠定了良好的技术基础。此外，鉴定分析高、低活力水牛精于之间以及高畸形率、正常水牛精子之间的差异表达蛋白信息，有利于理解精子活力低下、形态结构异常的分子机制并为找到与精子活力、形态相关的分子标记物提供线索。关键词：水牛精液蛋白质组双向电泳质谱差异蛋白STUDIESONBUFFALOSEMENPROTEOMICSABSTRACTSemencompositionisfundamentaltomalerep

7、roductivediseases．Inrecemyears，thedevelopmentofproteomicshasprovidedaneweffectivemetllodforsemencharacterization．Sofar,proteomicshasbeenusedforsemenIIesearchinhuman，mouseandotheranimalstohelpUSunderstandthemolecularmechanismsofspermatogenesisandfortreatmentofmalerepro

8、ductivediseases．Inthisstudy，researchonbuffalosemenproteomicshasbeendevelopedonthebasisofpreviousworkinourlaboratory．Theobjec