水牛卵母细胞及卵泡液蛋白质组的初步研究

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1、广西大学硕士学位论文水牛卵母细胞及卵泡液蛋白质组的初步研究姓名：刘振方申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：张明20120524水牛卵母细胞及卵泡液蛋白质组的初步研究摘要本研究以水牛卵母细胞和卵泡液为实验材料，通过双向电泳、液相色谱和质谱技术分析卵母细胞体外成熟过程中以及卵泡在发育过程中蛋白质表达的差异性。论文共包括两部分，第一部分为文献综述部分，第二部分为研究部分。研究一：本试验以水牛卵母细胞为对象，通过采用双向凝胶电泳的方法来建立和优化水牛卵母细胞双向凝胶电泳的条件，并对比分析卵母细胞成熟前后蛋白质表达的差异性。结果显示：裂解液A

2、(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS和0．5％DTF)提取的总蛋白采用pH4～7、13cmIPG胶条上能够清晰得到水牛卵母细胞双向电泳图谱。成熟前后卵母细胞蛋白双向电泳图谱经ImageMaster软件对比分析，检测出约300个蛋白质点，并发现水牛卵母细胞成熟前后共存在27个差异蛋白，其中成功鉴定了8个蛋白质，包括HSP60蛋白，、HSC71蛋白，MVP蛋白，GEMIN8蛋白等。说明双向电泳技术可以用于水牛卵母细胞生长发育成熟分子机理的研究。成功鉴定的这些在成熟后表达上调的差异蛋白质可以作为水牛卵母细胞发育成熟的潜在标记物。研究二：本试验是以水牛卵泡

3、液为研究对象，通过采用双向凝胶电泳的方法来建立和优化水牛卵泡液双向凝胶电泳的条件，为以后研究卵泡液发育过程中蛋白质的变化奠定基础。结果显示：TCA／丙酮沉淀法处理得到的总蛋白，当采用24cm、pH3～lO非线性(Nonlinear,NL)胶条及上样量为150gg时，可获得较好的卵泡液总蛋白质2一DE图谱；运用ImageMaster2Dplatinum分析软件检测出约300个蛋白质点。研究三：以水牛卵泡液为试验材料比较不同直径水牛卵泡液(直径<4mnl、直径4～8mln、直径>8mm)的蛋白质和多肽表达变化。试验一：采用基质辅助激光解离串联飞行时间质

4、谱(MALDI—ToF／TOFMS)建立水牛卵泡液的多肽表达模型。结果表明：三种形态的卵泡液存在12个显著差异多肽，其中在大卵泡内上调6个，下调有2个。其中分子量1746Da的多肽在大卵泡中特异性表达，可作为卵泡成熟的潜在生物标志物之一。试验二：采用液相色谱一质谱(LC—MS)分离鉴定技术，经过液相色谱分离并收集显著差异的馏分，还原烷基化处理后酶解成肽段，再经反相色谱二次分离后质谱鉴定。结果表明，在大卵泡中存在显著高表达的蛋白质峰，质谱鉴定结果为转铁蛋白(Transferrin，TI强)。该蛋白质的高表达可作为潜在排卵的标志物之一。同时，本研究采用

5、的LC．MS技术将为卵泡液大规模蛋白质组分离和表达谱构建打下实验基础。综上所述，本研究建立了水牛卵母细胞成熟前后的双向电泳图谱和不同直径卵泡内卵泡液的蛋白质双向电泳图谱，通过分析期差异，筛选出了一批与卵子生长发育相关的候选蛋白质。为更加全面真实的揭示生殖细胞的发育机理及提高水牛繁殖效率打下了一定的理论基础。关键词：水牛卵母细胞卵泡液双向电泳蛋白质组液相质谱PRELIMINARYSTUDIESONTHEPROTEOMICSOFBUFFALOOOCYTESANDFOLLICULARFLUIDABSTRACTInthisstudy,two-dimensi

6、onalelectrophoresis，liquidchromatography,矗dmassspectrometrywereusedtoanalysisthedifferentproteinexpressioninbuffalooocytesduring加vitromaturationandduringdevelopment．Thethesisconsiststwosections：thefirstisaliteraturereview,andtheseconddescribestheresearchinthreeparts．PartI：Thec

7、onditionsfortwo—dimensionalproteinexpressionofbuffalooocyteswereestablishedandoptimized，andthedifferencesduring／nvitromaturationwerecompared．TheresultsindicatedthatlysisbufferA(7Murea，2Mthiourea，4％CHAPSand0．5％DTT)Wassuitableforproteinextraction．Aclear2DEmapWasobtainedin13cmpH4

8、～7。drystrips，andabout300spotsweredetectedusingImageMaster2Dpl