羊卵泡卵母细胞孤雌激活研究论文

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1、羊卵泡卵母细胞孤雌激活研究论文.freelin，然后在6-DMAP中激活4h，6-DMAP的浓度设置为0.5mM、1.0mM、2.0mM和3.0mM；结果表明，浓度为2.0mM和3.0mM6-DMAP激活的卵母细胞卵裂率（37.50%）显著高于其他各组（P＜0.01）。试验2，体外成熟的卵母细胞经5M离子霉素激活5min，然后在2.0mM6-DMAP中激活1h、3h、5h、7h和9h；结果表明.freelycin和乙醇为激活剂时，6-DMAP的孵育时间以5h为宜。Ionomycin比乙醇激活效果好，但乙醇与Ionomycin简单便

2、捷。【关键词】羊；卵母细胞；孤雌激活Thestudyonparthenogeicactivationofsheepoocytes【Abstract】Parthenogeicactivationofoocytesportanttechnologyofembyosproductioninvitro.Thisexperimentprovedevelopmentofparthenogeicembryosfolloentsofethanol，ionomycin，and6-DMAP.InExperiment1，invitromaturedoo

3、cytesycinor7%ethanolfor5minfolloM，1.0mM，2.0mMand3.0mM；TheresultshoMand3.0mM6-DMAPgroupsent2，invitromaturedoocytesycinfor5minfolloM6-DMAPfor1h，3h，5h，7hor9h;TheresultshoRNA的补充等一系列激活反应，最终导致原核的形成、DNA合成的起始和卵裂；卵母细胞孤雌激活是一种人工激活卵的方式，通过电脉冲、Ionomycin、乙醇、钙离子载体、放线菌酮和1，4，5-三磷酸肌醇（IP

4、3）等都可以引起卵母细胞的激活，使MII期卵母细胞不经过受精过程完成早期胚胎发育，获得孤雌胚胎。孤雌激活与体外受精都是以MII期卵母细胞为起点，都能获得早期胚胎，但孤雌激活与体外受精存在本质的区别；前者是人工活化卵母细胞，后者是自然活化卵母细胞；孤雌激活胚是通过抑制第二极体排放，使其与原来的卵母细胞核融合构成二倍体的胚胎，而体外受精胚胎是由雌雄配子融合所获得的胚胎，孤雌激活和体外受精是两项相对独立的技术但又有密切的联系。目前大部分哺乳动物体外受精产生胚胎的发育率和妊娠率都比较低，但有试管动物相继诞生；孤雌生殖的动物个体仅获得早期胚

5、胎，还没有妊娠成功的报道。本研究针对影响孤雌激活的主要因素，比较了Ionomycin、乙醇与6-DMAP对成熟卵母细胞的激活效果，旨在建立一套快速、便捷的卵母细胞体外激活方法，提高孤雌激活的效果与可操作性。1材料与方法1.1实验材料1.1.1主要仪器体视显微镜：日本NICON，SMZ800-C-EPI；CO2培养箱：美国，Formascientific3336型；双人单面垂直流超净台：上海，ZHJH-1115。1.1.2试剂与耗材一次性塑料培养皿为Nunclon公司产品；培养用TCM199和胎牛血清（FBS）由Gibco公司生产，

6、其他所有化学试剂除特别指明外，均为Sigma公司生产；FSH、LH和17-E2购自宁波激素制品公司。1.1.3操作液1.1.3.1卵母细胞成熟液TCM-199，HEPES10mM，丙酮酸钠0.38mM，FBS10%，17-E21g/ml，LH20g/ml，FSH10μg/ml，青霉素100U/ml，硫酸链霉素100U/ml。1.1.3.2胚胎培养液SOFaa胚胎培养液为基础液，另加HEPES10mM，5%FBS，EDTA0.1mM，青霉素100U/ml，硫酸链霉素100U/ml。1.2实验方法1.2.1卵母细胞成熟与孤雌激活前处理

7、卵母细胞采集后成熟培养23～24h后，去除卵母细胞外的所有卵丘细胞，挑选明显具有第一极体的成熟卵母细胞进行孤雌激活试验。1.2.2孤雌胚体外培养各种处理后的卵母细胞放入预先制备好的颗粒细胞单层的胚胎培养液微滴内进行共培养，每48h半量换液1次。1.2.3实验设计与结果统计本研究针对用于卵母细胞孤雌激活的两种常用方法，比较了Ionomycin、乙醇与6-DMAP不同浓度组合对卵母细胞激活效果的影响，试验设计具体如下。实验1：Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响。选择成熟良好且去除卵丘细胞的卵母细胞，在

8、含5μMIonomycin的胚胎培养液内激活5min，用胚胎培养液洗3次后，移入含有0.5mM、1.0mM、2.0mM和3.0mM6-DMAP的胚胎培养液内培养4h，然后用无Ionomycin和6-DMAP的胚胎培养液洗涤3次，移入正常胚胎培养液中