人端粒酶逆转录酶基因的转染对牛耳成纤维细胞寿命及核移植的影响

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1、⑧西北农林讲捉大学2007届攻读硕士学位研究生学位(毕业)论文人端粒酶逆转录酶基因的转染对牛耳成纤维细胞寿命及核移植的影响学科专业研究方向研究生指导教师完成时间筮壹生塑堂噎塾动塑墅脸王程随亟娜瑟涵熬援．一窒QQZ生鱼旦墨旦人端粒酶逆转录酶基因的转染对牛耳成纤维细胞寿命及核移植的影响摘要由于成纤维细胞具有有限的分裂次数，在50PDs左右进入衰老阶段，80PDs左右进入危机阶段，细胞凋亡。所以成纤维细胞这种“短暂”的寿命，是无法满足转基因核移植的要求的，限制了在科研和实际当中的应用。作为转基因核移植的供体细

2、胞，至少要能存活到45PDs以上，这样才能保证外源基因在细胞内的整合和正常表达，以及其它为核移植的所作的前期准备工作的顺利完成。本试验将携带有增强型绿色荧光蛋fl(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)报告基因和人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereverselranseriptase,hTERT)目的基因的质粒PEGFPCI-hTERT通过脂质体转染法转入牛耳成纤维细胞，并考察其寿命以及对核移植的影响，为生产转基因动物做准备。1、用含10％rtn清DM

3、EM培养液培养牛耳成纤维细胞，通过脂质体Lipofaetamine2000将外源端粒酶逆转录酶基因hTERT转入牛耳成纤维细胞，用荧光显微镜观测EGFP的表达，用600ug／mLG418筛选获锝阳性克隆，然后换为含300ug／mL0418的培养液继续培养使阳性克隆得到扩增。2、获得的阳性克隆提取RNA，设计特异性引物进行RT-PCR反应，经电泳分析在443bp处出现目的条带，未转染的细胞无目的条带。转染后的12代(TNl2)和22代(TN22)细胞端粒酶活性检测均呈阳性，未转染的细胞无端粒酶活性。3、测

4、定阳性细胞12代(TNl2)和22代(1N22)以及阴性细胞12代(N12)和22代(N22)的生长曲线与群体倍增次数进行比较。群体倍增指数分别为4．14-士0．13，3．27-20．09，3．14：L-0．06，2．06-1-0．05，TN22与N12差异不显著《p>o．05)，TNl2和N22与各组均差异显著①如．05)。结果显示阳性细胞生长速度明显高于未转染的阴性细胞，寿命延长，但只越过了衰老期(50PDs左右)，没有越过危机期(80PDs左右)，不能永生化。经流式细胞仪检测，阳性细胞凋亡率明显降

5、低，核型正常。4、用55PDs阳性细胞(1N14)与21PDs的阴性细胞(N7)长满瓶皿后分别做供体细胞进行核移植，比较卵裂率，囊胚率和囊胚细胞数。结果两者的卵裂率，囊胚率差异均不显著0>o．05)，但是阳性细胞的囊胚细胞数有所减少与阴性细胞差异显著(p《O．05)。关键词牛耳成纤维细胞，人端粒酶逆转录酶基因，细胞寿命，核移植EFFECTOFHUⅣ【ANTELOMERASEREVERSETRANSCRIP，I=ASEoNLIFESPANOFBOⅥNEEARFIBROBLASTANDNUCLEARTRAN

6、SFERABSTRACTDuetothelimitationofcelllifespan,thefibroblastsbeginintoSenefll∞-bilceat50PDsandtOcrisisst80PIDs．Itcannotbesatisfiedwiththedemandofnucleartransferandlimitthepmetiealapplicationin,跚arehworks．InordertobeSUl"etheexlrag朗e啪beintegratedandexpressed

7、normallyincells,aSthedonorcellsfortransgenienuclearIransfel*，thefibroblastsshouldatleastsurviveabove45PDs．ThisexperimenttransferedtheplasmidwlaiehwaswithEGFPreportgeneandhTERTgenetobovineearfibroblastthroughthelipofaetamine2000and,旧aviewedtheeffectOnnucl

8、eartransfer,andputafundamentalstepsforproducingtransgenicanimals．1．Wbculturedthebovinee盯fibroblastusingDMEM谢th10％FBS．thentransfercdtheextmhTERTgenetocellsofthistypethroughthelipofaetamine2000．After48h’Weexaminedtheexpressi