人端粒酶逆转录酶基因rnai表达载体的构建、鉴定

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1、人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定：毛立军，郑骏年，李望，郑宏祥，刘俊杰，孙晓青，陈家存，温儒民【关键词】重组质粒　　摘要:目的构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的RNA干扰（RNAi）表达载体。方法化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）启动子的下游，构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。结果经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。结论已成功构建pSlienc

2、er-hTERT载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。　　关键词:RNA干扰;短发夹RNA;人端粒酶转录酶;重组质粒;　　Abstract:ObjectiveToconstructtheexpressingvectorofsmallhairpinRNA（shRNA）targetinghumantelomerasere-versetranscriptase（hTERT）gene.MethodsTplateDNAoligonucleotidesforshRNAexpressiontargetedhTERTgeneically

3、synthesized.TheannealedshRNAtemplatesidsPilencer-hTERT.ResultsItonstratedthatshRNAtemplatetargetinghTERTgenehadbeeninsertedattheex-pectedsiteandtheinsertionsequenceethodtodevelopspecifichTERT-silencingtherapeutics.　　KeyallhairpinRNAs;humantelomerasereversetranscriptase;

4、rebinantplasmid　　端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒DNA得以延长使细胞永生。端粒酶逆转录酶（hTERT）是催化这一反应的惟一限速酶，因此有希望成为肿瘤治疗的理想靶点。RNA干扰是近年迅速发展起来的一项新的基因阻断技术，能特异、高效地阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具［1］。本实验将针对hTERTmRNA的小干扰RNA（siRNA）模板插入siRNA表达载体，构建载体hTERT-siRNA表达载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。　　1材料和方法　　1.1主要试剂

5、pSilencer1.0-U6质粒为美国Am-bion公司产品，大肠杆菌JM109由徐州医学院生物化学教研室保存。T4DNA连接酶以及小量质粒提取试剂盒购自Promega公司，限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ购自MBI公司。　　1.2实验方法　　1.2.1模板DNA合成选择2段hTERTmRNA的序列作为RNA干扰的靶序列，序列一针对的是hTERT基因显性失活突变体区（NM003219:碱基序列位置2182-2200）。序列二采用Ambin公司的网上设计软件（.ambion.）进行设计，所对应的的靶序列为hTERT（NM003219

6、:747-765）。设计2对编码短发夹RNA序列的DNA单链。序列一:P1:5′-CAAGGTGGATGTGACGGGCTTCAAGAGAGCCC-GTCACATCCACCTTGTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAA-AAAAGCCCGTCACATCCACCTTGTCTCTTGAACAAG-GTGGATGTGACGGGCGGCC-3′。序列二:P1:5′-GTCTGCCGTTGCCCAAGAGTTCAAGAGACTCTTGGG-CAACGGCAGACTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAAAAA-AGTCTGCCGTTGCC

7、CAAGAGTCTCTTGAACTCTTGG-GCAACGGCAGACGGCC-3′。其顺序为ApaⅠ酶切位点、19nt正义序列、9ntloop接头序列、19nt反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子（6个T）、EcoRⅠ酶切位点。单链两端包含保护碱基和EcoRⅠ（AATT）以及ApaⅠ（GGCC）酶切残基，能直接与pSilencer1.0-U6siRNA线性表达载体连接。由Introvigen生物公司合成。　　1.2.2质粒pSilencer-hTERT表达载体的构建　　1.2.2.1寡核苷酸的退火将合成的模板寡核苷酸溶解在100μl无核酶

8、水中，取1μl用TE（10mmol.LTris，1mmol.LEDTA）稀释，使终浓度为1g.L。取正义模板链、反义模板链各2μl加入46μl的退火缓冲液，在90℃孵育3min，37℃孵育1h。退火后形成的双链用3%凝胶