人端粒酶逆转录酶基因rnai表达载体的构建、鉴定论文

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1、人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定论文.freelallhairpinRNA（shRNA）targetinghumantelomerasere-versetranscriptase（hTERT）gene.MethodsTplateDNAoligonucleotidesforshRNAexpressiontargetedhTERTgeneicallysynthesized.TheannealedshRNAtemplatesidsPilencer-hTERT.ResultsItonstratedthatshRNAtemplatetargetinghTERTgenehad

2、beeninsertedattheex-pectedsiteandtheinsertionsequenceethodtodevelopspecifichTERT-silencingtherapeutics.KeyallhairpinRNAs;humantelomerasereversetranscriptase;rebinantplasmid端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒DNA得以延长使细胞永生。端粒酶逆转录酶（hTERT）是催化这一反应的惟一限速酶，因此有希望成为肿瘤治疗的理想靶点。RNA干扰是近年迅速发展起来的一项新的基因阻断技术，能特异、高

3、效地阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具［1］。本实验将针对hTERTmRNA的小干扰RNA（siRNA）模板插入siRNA表达载体，构建载体hTERT-siRNA表达载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。1材料和方法1.1主要试剂pSilencer1.0-U6质粒为美国Am-bion公司产品，大肠杆菌JM109由徐州医学院生物化学教研室保存。T4DNA连接酶以及小量质粒提取试剂盒购自Promega公司，限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ购自MBI公司。1.2实验方法1.2.1模板DNA合成选择2段hTERTmRNA的序列作为RNA干扰的靶序列，序列一针对

4、的是hTERT基因显性失活突变体区（NM003219:碱基序列位置2182-2200）。序列二采用Ambin公司的网上设计软件（.ambion.）进行设计，所对应的的靶序列为hTERT（NM003219:747-765）。设计2对编码短发夹RNA序列的DNA单链。序列一:P1:5′-CAAGGTGGATGTGACGGGCTTCAAGAGAGCCC-GTCACATCCACCTTGTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAA-AAAAGCCCGTCACATCCACCTTGTCTCTTGAACAAG-GTGGATGTGACGGGCGGCC-3′。序列二:P1:5′-GTCTGCCGTT

5、GCCCAAGAGTTCAAGAGACTCTTGGG-CAACGGCAGACTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAAAAA-AGTCTGCCGTTGCCCAAGAGTCTCTTGAACTCTTGG-GCAACGGCAGACGGCC-3′。其顺序为ApaⅠ酶切位点、19nt正义序列、9ntloop接头序列、19nt反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子（6个T）、EcoRⅠ酶切位点。单链两端包含保护碱基和EcoRⅠ（AATT）以及ApaⅠ（GGCC）酶切残基，能直接与pSilencer1.0-U6siRNA线性表达载体连接。由Introvigen生物公司合成。1.2.2质粒pSilen

6、cer-hTERT表达载体的构建1.2.2.1寡核苷酸的退火将合成的模板寡核苷酸溶解在100μl无核酶水中，取1μl用TE（10mmol.LTris，1mmol.LEDTA）稀释，使终浓度为1g.L。取正义模板链、反义模板链各2μl加入46μl的退火缓冲液，在90℃孵育3min，37℃孵育1h。退火后形成的双链用3%凝胶电泳，以10倍稀释的合成的单正链为对照，检测退火前后电泳图谱是否有变化。1.2.2.2寡核苷酸与pSilencer1.0-U6连接将针对不同hTERT序列的2对退火后的模板链与pSi-lencer1.0-U6线性表达载体连接，重组后的载体命名为pSilencer-

7、hTERT1、pSilencer-hTERT2。按下列操作进行:取5μl退火后的模板链用45μl无核酶水稀释成终浓度8mg.L，建立10μl反应体系:1μl上述稀释退火模板链、6μl无核酶水、1μl10×T4DNA连接酶缓冲液、1μlpSilencer1.0-U6、1μlT4DNA连接酶（5U.μl）。16℃孵育过夜。将重组载体转化感受态细胞JM109后提取质粒。1.2.3阳性克隆鉴定1.2.3.1酶切鉴定用BamHⅠ或HindⅢ单酶切重组质粒，所有各管于37℃水浴过夜。取7μl