人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定（医学论文）

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1、人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建.鉴定作者：毛立军，郑骏年，李望，郑宏祥，刘俊杰，孙晓青，陈家存，温儒民【关键词】重组质粒摘要：目的构建端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体。方法化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA(shRNA)序列的寡核昔酸，退火处理后克隆到pSilencerl.0-U6shRNA表达载体的U6RNA聚合酶皿(Polffl)启动子的下游，构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERTo结果经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。结论已成功

2、构建pSliencer-hTERT载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。关键词:RNA干扰;短发夹RNA;人端粒酶转录酶;重组质粒；Abstract:ObjectiveToconstructtheexpressingvectorofsmallhairpinRNA(shRNA)targetinghumantelomerasere-versetranscriptase(hTERT)gene.MethodsTwotemplateDNAoligonucleotidesforshRNAexpressiontarget

3、edhTERTgenewerechemicallysynthesized.TheannealedshRNAtemplateswereprocessedtoproduceandidentifytherecombinantRNAiplas-midsPilencer-hTERT.ResultsItwasdemonstratedthatshRNAtemplatetargetinghTERTgenehadbeeninsertedattheex-pectedsiteandtheinsertionsequencewasperfectl

4、ycorrect.ConclusionRNAiexpressionvectortargetinghTERTgenehasbeenconstructedsuccessfullyandwillbeusedasausefulmethodtodevelopspecifichTERT-silencingtherapeutics・Keywords:RNAinterference;smallhairpinRNAs;humantelomerasereversetranscriptase;recombinantplasmid端粒酶的活化与

5、恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒DNA得以延长使细胞永生。端粒酶逆转录酶(hTERT)是催化这一反应的惟一限速酶，因此有希望成为肿瘤治疗的理想靶点。RNA干扰是近年迅速发展起来的一项新的基因阻断技术，能特异、高效地阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具［1］。本实验将针对hTERTmRNA的小干扰RNA(siRNA)模板插入siRNA表达载体，构建载体hTERT-siRNA表达载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。1.1主要试剂pSilencerl.0-U6质粒为美国Am-bion

6、公司产品，大肠杆菌JM109由徐州医学院生物化学教研室保存oT4DNA连接酶以及小量质粒提取试剂盒购自Promega公司，限制性内切酶BamHI和HindHI购自MBI公司。1.2实验方法1.2.1模板DNA合成选择2段hTERTmRNA的序列作为RNA干扰的靶序列，序列一针对的是hTERT基因显性失活突变体区(NM003219:碱基序列位置2182-2200)o序列二采用Ambin公司的网上设计软件(www.arnbion.com)进行设计，所对应的的靶序列为hTERT(NM003219:747-765)。设计2对编码

7、短发夹RNA序列的DNA单链。序列:P1:5'-CAAGGTGGATGTGACGGGCTTCAAGAGAGCCC-GTCACATCCACCTTGTTTTTT-3',P2:5'-AATTAA-AAAAGCCCGTCACATCCACCTTGTCTCTTGAACAAG-GTGGATGTGACGGGCGGCC-3'。序列二：Pl:5‘-GTCTGCCGTTGCCCAAGAGTTCAAGAGACTCTTGGG-CAACGGCAGACTTTTTT-3',P2:5'-AATTAAAAA-AGTCTGCCGTTGCCCAAGAGTCTC

8、TTGAACTCTTGG-GCAACGGCAGACGGCC-3'。其顺序为ApaI酶切位点、19nt正义序列、9ntloop接头序列、19nt反义序列、RNA聚合酶DI终止子(6个T)、EcoRI酶切位点。单链两端包含保护碱基和EcoRI(AATT)以及ApaI(GGCC)酶切残基，能直接与pSilencerl.0-