htert(人端粒酶逆转录酶基因)转染雪旺细胞后对其影响的实验研究

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1、hTERT(人端粒酶逆转录酶基因)转染雪旺细胞后对其影响的实验研究计：学位论文：26页表格：0个插图：8幅刘大壮指导教师：曲巍教授申请学位级别：硕士学位论文提交日期：2012年4月学位授予单位：大连医科大学专业名称：外科学论文答辩日期：2012年5月学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机

2、构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：玉坐签字日期：竺!三年土月尘日关于学位论文使用授权的说明《hTEI汀(人端粒酶逆转录酶基因)转染雪旺细胞后对其影响的实验研究》系本人在大连医科大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本人及指导教师完全了解大连医科大学关于保存、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅，同意学校将本论文加入：1．中国学术期刊(光盘版)电子

3、杂志社——《中国博士学位论文全文数据库》、《中国优秀硕士学位论文全文数据库》及CNKI相关数据库。2．中国科学技术信息研究所——《中国学位论文全文数据库》3．国家图书馆本人授权大连医科大学，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文，可以公布论文的全部或部分内容。论文作者签名：指导教师签名：签字日期：c乡!蛑』刍蚴目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正

4、文⋯⋯000OOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1O(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOOOOOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯00OOODO0OO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14(一)综述⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯t⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··14(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯0OBO0⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19四、附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯··2l五、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26hTERT(人端粒酶逆转录酶基因)转染雪旺细胞后对其影响的实验研究硕士生姓名：孑旨导教师：指导小组：专业名称：刘大壮曲巍教授蒋华军老师外科学摘要目的：1．采用7天左右的新生SD大鼠的雪旺细胞用脂质体转染的方法进行hTERT的转染，体外分离培养，探索安全、高效的脂质体转染方法期

6、望获得永生化的雪旺细胞。2．对转染后的雪旺细胞和未转染的雪旺细胞在细胞的增殖周期、形态、分泌功能方面的变化进行对比检测，通过具体的实验证明细胞永生化以后的优势和缺点，对永生化的雪旺细胞应用于神经组织工程奠定基础。方法：1．选取出生后7天左右的SD大鼠，冰冻处死后碘伏浸泡消毒，取其坐骨神经以及臂丛神经，剪碎至lnun3大小的组织块，双酶消化法进行体外分离培养，待细胞生长到85％汇合密度时用低浓度胰酶快速消化传代，30分钟差速贴壁法进一步纯化雪旺细胞，用光学显微镜进行形态学观察并拍照，S．100蛋白免疫荧光鉴定拍照

7、。2．将纯化的雪旺细胞用含hTERT基因的质粒经脂质体转染法转染雪旺细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，待细胞生长满80％密度时更换含G418(100ug／m1)的完全培养基，每3天换液1次，筛选2周，转入含hTERT基因的质粒的细胞经过筛选获得阳性克隆后继续传代培养，传代后的细胞一部分用于S．100蛋白免疫荧光鉴定，流式细胞仪检测转染后雪旺细胞以及未转染细胞对照组的细胞周期，免疫印迹Westernblot法分别检测转染雪旺细胞的的5、10、15、20代以及对照组未转染雪旺细胞神经营养因子(NG

8、F)的分泌。结果：1．经双酶消化法可以获得大量增殖的雪旺细胞，差速贴壁传代后可以获得典型的长梭形放射状肩并肩排列的雪旺细胞，光镜视野下雪旺细胞纯度可以达到90％以上，成纤维细胞量少，经S．100蛋白免疫荧光测定鉴定为雪旺细胞2．脂质体转染法转染hTERT后光学显微镜观察可见转染后的雪旺细胞胞体体积大，长梭形。无规则贴壁生长，胞质黄色，经S—100免疫荧光鉴定为雪旺细胞3．流式细胞仪检测