siRNA沉默hTERT基因对人胰腺癌的凋亡和耐药基因的影响

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1、siRNA沉默hTERT基因对人胰腺癌的凋亡和耐药基因的影响中山大学附属第二医院消化内科博士学位申请人钟英强导师朱兆华教授摘要翮吾胰腺癌(pancreaticcancer，PC)是消化系统中较常见的恶性肿瘤之一，且近年来全球胰腺癌发病率呈上升趋势，我国胰腺癌发病率在近20年内增加了4倍。目前所采用的化疗、放射、免疫和内分泌等非手术疗法，对胰腺癌的疗效均较差，其主要原因之一是与胰腺癌组织中的端粒酶(telomerase)、抗凋亡基因和耐药基因的高表达有关。近几年来，虽然胰腺癌的临床多模式综合治疗水平不断提高，但对其远期疗效和预后并未带来突破性的

2、进展，随着分子生物学及相关学科研究的深入，胰腺癌的基因治疗被认为是继手术、放疗和化疗等传统疗法之后肿瘤治疗的新模式。人类端粒酶主要由3个亚单位组成：端粒酶RNA、端粒酶结合蛋白和端粒酶逆转录酶(humantelomerase陀versetranscriptase，hTERT)，其能够利用3’一端粒作为引物，以自身RNA组分为模板来逆转录合成端粒DNA序列，并不断添加到染色体末端，从而维持端粒长度的稳定。hTERT在体内外组织细胞中均与端粒酶活性密切相关。近期的研究表明hTERT只在端粒酶阳性细胞中表达，hTERT所编码的基因mRNA水平与端粒

3、酶活性一致，是端粒酶活性表达的限速因子。因此，调控hTERT的表达已成为调节端粒酶活性的主要手段，而hTERT基因是当前端粒酶基因治疗的主要靶点之一。近年来，随着对hTERT的功能的深入研究发现，hTERT除调控端粒酶活性外，还可调节控制细胞生长的多种基因的表达，抵抗肿瘤细胞的凋亡作用和对DNA损伤有修复功能，hTERT的上调与其他基因共同促进肿瘤的发生，而这些功能不依赖于端粒的稳定性，即是hTERT的端粒外功能，已成为目前研究的热点。环氧合酶一2(Cyclooxygenase-2，COX一2)基因是与肿瘤细胞的增殖和凋亡有关的基因，其表达产

4、物COX蛋白，为花生四烯酸代谢过程的关键酶。而COX-2促进肿瘤的发生是否与hTERT有关，国外有个别文献报道COX-2抑制剂对端粒酶的活性有影响，未见在基因水平上进行两者的关系研究。多药耐药(multidrugresistance，MDR)基因是导致许多肿瘤化疗失败的原因之一，其qbMDRl编码的P一糖蛋白(P-glycoprotein，P—gP)是一种能量依赖性的药物排出泵，通过ATP提供能量，将化疗药物由细胞内泵出细胞外，使其抗肿瘤细胞作用减弱或消失而表现为耐药性，因此，P—gp可作为化疗的敏感指标之一。MDR表型的细胞常呈现出抗细胞凋

5、亡特性，其可能是MDR的本质之一。Bcl-2是一种凋亡抑制基因，其过度表达使化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用转变为对细胞死亡的抑制而致耐药，故Bcl一2被认为是一种新的耐药相关基因。研究表明Bcl一2过度表达常伴端粒酶活性的增高。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术为肿瘤的基因治疗提供了崭新的理念和途径。双链RNA(double．StrandedRNA，dsRNA)能抑制同源互补序列的基因表达，称为RNAi。RNAi可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。RNAi是一种转录后

6、基因表达的调控机制，目前被广泛应用于功能基因组和基因治疗的研究。RNAi技术能抑制特异的基因表达，治疗恶性肿瘤，能减少非特异作用引起的副作用。因此，siRNA不仅被用作探讨细胞基因功能的工具，而且可应用siRNA抑制致病基因的表达，开拓出治疗各类疾病，特别是恶性肿瘤的新型基因药物。研究目的本课题是应用免疫组织化学染色技术，在蛋白质水平上研究hTERT基因在人胰腺癌组织中的表达及其与P—gP、Bcl-2、COX一2蛋白表达和临床病理特征的关系。利用RNAi技术靶向沉默胰腺癌细胞的hTERT基因表达，在基因水平上研究hTERT-siRNA对胰腺癌

7、细胞的增殖、凋亡、细胞周期以及对P—gP、Bcl一2和COX-2基因表达的影响。材料与方法主要材料l胰腺癌手术切除后存档的石蜡包埋标本38例，慢性胰腺炎标本25例，正常胰腺组织标本20例。2人胰腺腺癌Capan一2细胞株、SWl990细胞株。33条hTERT—siRNA序列：siNM一198253—001：靶序列：GCTCGTGGAGACCATCTlT，正义链(5’一3’)：GCUCGuGGAGACCAUCUUUdTdT，反义链(3’一5’)：dTdTCGAGCA-CcUCUGGUAGAAA。siNM—198253一002：靶序列：GGCCG

8、ATTGTG从CATGGA，正义链(5’一3’)：GGCCGAUUGUGAACAUGGAdTdT，反义链(3’一5’)：dTdTCCGGCUAAC—ACUUGUAC