βCATENIN基因转染对人毛囊干细胞增殖的影响

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1、上海交通大学硕士学位论文β-catenin基因转染对人毛囊干细胞增殖的影响姓名：杨鹏高申请学位级别：硕士专业：外科学（烧伤整形）指导教师：方勇20090501上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并

2、向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海交通大学硕士学位论文β-catenin基因转染对人毛囊干细胞增殖的影响摘要研究背景和目的严重皮肤缺损如严重大面积烧伤创面的修复仍是目前临床工作的重点和难点。以皮肤干细胞为种子细胞构建组织工程化皮肤是新的发展方向。研究表明，毛囊干细胞具有高增殖和多向分化的潜

3、能，在维持机体的自稳及皮肤组织的自我更新中具有重要作用，有望成为皮肤修复和组织工程皮肤种子细胞的重要来源之一。因此，毛囊干细胞吸引了众多在创伤修复及组织工程领域学者的研究兴趣。干细胞的显著特点是慢增殖周期，而作为种子细胞需要一定的数量和增殖速度。毛囊干细胞是近年来创伤修复和组织工程领域的研究热点，同时也取得了一定的研究进展。但是，迄今为止距离将其作为大量提供给组织工程化皮肤的来源、或常规的用于临床治疗的来源仍有很大的困难，其主要原因是对毛囊干细胞的认识仍不够完善，尤其是对如何调控和诱导毛囊干细胞增殖和分化的机制尚不明确，缺乏有效地培养及诱导毛囊干细胞增殖的措施及手段。因此，探讨调控毛囊干细胞

4、增殖的信号途径及分子机制，找寻一种促进毛囊干细胞体外大量增殖的有效途径，无疑将为进一步诱导其定向分化并最终推动创伤修复及组织工程化皮肤研究的发展具有重要的理论意义。许多研究证明，Wnt/β-catenin信号通路是一条控制细胞命运及组织1上海交通大学硕士学位论文器官形态发生的重要通路。β-catenin不仅具有介导细胞粘附的能力，而且是Wnt/β-catenin信号通路中调控干细胞增殖分化的关键分子。而目前关于β-catenin对人毛囊干细胞增殖影响的研究国内外鲜有报道，如果能够通过干预毛囊干细胞内β-catenin的表达促进其增殖，无疑将为构建组织工程皮肤提供充足的种子细胞。本研究通过构建

5、β-catenin慢病毒载体，进而转染毛囊干细胞，观察其对毛囊干细胞增殖的影响，以期为进一步诱导毛囊干细胞定向分化和构建组织工程皮肤奠定重要理论基础。研究方法1、通过中性蛋白酶-胰蛋白酶消化法分离人毛囊干细胞，结合低钙角质细胞无血清培养基培养；通过免疫荧光染色法检测CD200、K19、β-integrin、LEF1表达情况以鉴定人毛囊干细胞并观察随培养时间延长其表面标志物变化；倒置显微镜下观察细胞贴壁、增殖的形态学特征；选用MTT法和罗丹明B-硫酸尼罗蓝染色法分别检测人毛囊干细胞的增殖特性及克隆形成能力；用β-半乳糖苷酶染色法检测人毛囊干细胞衰老程度。2、提取人血管内皮细胞总RNA，应用逆转

6、录PCR（RT-PCR）方法，以自行设计的带有酶切位点的引物，扩增获得β-catenin基因全部序列，构建T-A克隆，酶切此亚克隆到pGC-FU-EGFP载体上，转化感受态细菌，筛选阳性克隆，PCR及测序鉴定正确后，脂质体法转染FT293细胞，Western-blot检测β-catenin-EGFP融合蛋白表达，然后进行包装，得到含有β-catenin-EGFP融合基因的慢病毒，通过Real-time定量PCR法测定病毒滴度。3、设立阴性对照组、空病毒对照组和病毒组，将β-catenin慢病毒感染毛囊干细胞；MTT法检测感染前后毛囊干细胞的增殖活性；罗丹明B和2上海交通大学硕士学位论文硫酸尼

7、罗蓝染色法检测感染前后毛囊干细胞克隆形成能力；免疫荧光染色法检测感染后毛囊干细胞β1-integrin表达情况。研究结果1、中性蛋白酶-胰蛋白酶消化法可获取数目多，活力高的毛囊隆突部细胞，经体外培养，共可传10代。经免疫荧光检测各代细胞均表达CD200、K19、β-integrin，而基本不表达LEF1。MTT结果显示：毛囊干细胞4～20天增殖最为活跃，3周后增殖能力开始下降。早期毛囊干细胞呈明显克隆性生长，