pxr受体激动剂高通量筛选模型的优化和天然活性成分的筛选

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1、目录英文缩略语1中文摘要3Abstract5第一部分基于PXR-CYP3A通路的HepG2工程细胞株稳定性检验和培养条件优化引言7材料与方法8结果10讨论16第二部分基于PXR-CYP3A4通路的药物相互作用筛选体系在“诸参辛芍叛藜芦”相反机制研究中应用引言17材料与方法18结果19讨论30第三部分利用PXR受体激动剂高通量筛选模型进行天然活性成分筛选1引言32材料与方法33结果34讨论56第四部分五味子甲素对石胆酸所致小鼠胆汁酸淤积性肝损伤的保护作用及机制探索引言57材料与方法59结果62讨论67结论69参考文献70个人简历74

2、研究成果74致谢75附录762英文缩略词bpBasepair碱基对CARConstitutiveandrostanereceptor组成型雄凿烷受体cDNAComplementarydeoxyrionucleicacid互补脱氧核糖核酸CYPCytochromeP450细胞色素P450DBDDNAbindingdomainDNA结合区DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPFourdeoxynucleotidetriphosphates四种脱氧核糖三磷酸

3、EBEthidiumbromide溴化乙锭FBSFetalbovineserum胎牛血清hPXRHumanpregnaneXreceptor人孕烷X受体LBDLigandbindingdomain配体结合区LCALithocholicacid石胆酸MEMMinimumEssentialMediumMEM培养基NEAAnonessentialaminoacid非必需氨基酸PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PCNPregnenolone16

4、α-carbonitrile16α-腈基-孕烯诺龙RIFRifampicin利福平RNARibonucleicacid核糖核酸RXRRetinoidXreceptor视黄醛X受体TCMTraditionalChinesemedicine中药3中文摘要PXR受体激动剂高通量筛选模型的优化和天然活性成分的筛选目的：利用本实验室前期构建完成的PXR-CYP3A稳定转染HepG2工程细胞株对中药单体成分进行高通量筛选，希望找到对PXR有激活作用的单体成分。首先对稳定转染细胞株的稳定性和细胞培养的基本条件进行了优化，随后对“诸参辛芍叛藜芦”

5、的各单味药水煎液和部分单体成分对该工程细胞株CYP3A4的诱导情况进行检测，考察30种单体成分的PXR激活及CYP3A诱导能力，试图从CYP3A角度解释“诸参辛芍叛藜芦”相反作用机制；接着对本实验保存的118种中药单体进行了PXR激活及CYP3A诱导情况筛选，最后对筛选所得诱导作用较强的单体成分五味子甲素用于石胆酸引起的肝损伤的保护作用进行了整体动物实验研究。方法：利用稳定转染工程细胞株作为筛选模型并结合报告基因技术对天然产物水提物和118种单体成分进行PXR激活特性高通量筛选；利用过量石胆酸造成小鼠肝脏损伤的模型，考察了五味子甲

6、素对PXR调控胆汁酸代谢相关靶基因表达影响及肝脏损伤的保护作用进行了考察。4结果：通过条件优化得到的最佳筛选条件是：细胞铺板密度为10×10，血清使用活性炭吸附胎牛血清（FBS），药物最佳处理时间为48h，利福平（RIF）有效刺激浓度为5μM；同时在对细胞筛选的稳定性和细胞生长环境变化对筛选信号强度的影响进行了考察：通常情况下由于药物加入导致细胞培养液pH值改变未对Gaussia荧光素酶稳定性产生明显影响，但是细胞生长会受到抑制；同时在高浓度DMSO条件下，细胞状态和荧光素酶分泌均保持稳定。利用该细胞筛选模型结合优化的条件，对“诸

7、参辛芍叛藜芦”中各单味药水煎液和单体成分激活PXR和诱导CYP3A4进行了筛选：结果显示人参水提物浓度在大于50mg/ml、北沙参和白芍水提物在5~100mg/ml条件下与MEM组比较都对报告基因信号具有抑制作用；而人参水提物在浓度为小于25mg/ml、南沙参水提物在浓度为50mg/ml、细辛水提物在浓度为10mg/ml的时候表现出较强激活效应。藜芦1.25mg/ml是细胞最适培养浓度，通过观察细胞生长情况，4发现藜芦组细胞生长缓慢，有细胞大量死亡情况出现，显示出较强的细胞毒作用。在对各单味药水提物筛选有明显的激活效应或抑制效应的

8、基础上，对各单味药所含的一些单体成分进行了筛选，希望找到水提物中真正起作用的单体成分，利用本实验室保存的人参、党参、丹参等的主要成分标准品进行筛选，结果显示人参的主要皂苷类成分荧光素酶报告基因的诱导倍数均低于RIF处理组，其中人参三醇、人参皂苷Rf