二型大麻受体激动剂筛选模型的建立及活性药物的筛选

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1、重庆医科大学硕士学位论文二型大麻受体激动剂筛选模型的建立及活性药物的筛选姓名：刘媛申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：董志201205重庆医科大学硕士研究生学位论文二型大麻受体激动剂筛选模型的建立及活性药物的筛选摘要背景与目：的：药物的活性筛选是研制新药的起点和具有决定意义的步骤。随着分子药理学、分子生物学、细胞生物学等学科的进展，高通量筛选已经成为发现新药的重要手段之一。采用高通量筛选模型可以在短时间内高效的筛选出先导化合物，进而用于新药的研发。G蛋白偶联受体作为药物靶点被广泛研究。根据受体．配体相互作用的理论建立起来的筛选方法，可以发现能

2、够与G蛋白偶联受体相结合的化合物。二型大麻受体(Cannabiniodreceptortwo，CB2)为大麻受体(Cannabiniodreceptor)的一种亚型。它由360个氨基酸组成，为7次跨膜G蛋白偶联受体。CB2受体主要分布于与免疫功能相关的外周组织中，包括巨噬细胞与B淋巴细胞。生理状态下在中枢神经系统也有分布，但表达量很低。此外，在子宫、胃肠道等部位也有CB2受体的分布。大量的研究表明，CB2受体在许多疾病的病理过程中起着重要的调控作用。CB2激动剂具有抑制炎症反应、改善微循环、抗癌、镇痛等作用。因此，研究开发出具有CB2活性的药物，

3、具有很大的医用基金项目：国家自然科学基金面上项目(81173066)：国家科技重大专项重大新药刨制(2010ZX09401—306-1-1)；重庆市自然科学基金重点项目(CSTC2009BA5086)重庆医科大学硕士研究生学位论文价值。本课题研究旨在建立以双荧光素酶报告基因检测的二型大麻受体激动剂的筛选模型。在模型建立成功的基础上，对一系列的中药单体和提取物进行初步筛选。以期能从其中筛选到具有激动CB2活性的药物，为新药研制做初步研究，同时使宝贵的中药资源得到更有效的利用。第一部分：二型大麻受体基因的pIRES2-EGFP质粒的构建及其真核表达方

4、法：首先采用聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)方法从质粒pcDNA3．1(+)一CB2中扩增获得人的CB2基因，再采用基因重组技术将CB2的DNA片段插入真核表达载体pIRES2．EGFP。将获得的plRES2．EGFP．CB2重组子转染人胚肾细胞(HEK293)细胞，应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescenceprotein，GFP)的表达情况，逆转录-聚合酶链式反应(TranscriptionpolymerasechainReaction，RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western

5、blot)检测CB2的表达情况。结果：酶切和测序结果验证真核表达载体plRES2．EGFP．CB2构建成功。RT-PCR与Westernblot分别检测到CB2mRNA与蛋白的表达，在荧光显微镜下能观察到绿色荧光。结论：成功构建了表达载体plRES2．EGFP，CB2，并实现其在真核细胞中的表达。第二部分：稳定表达二型大麻受体及双荧光素酶报告基因的细胞气重庆医科大学硕士研究生学位论文株的建立方法：将目的基因质粒pIRES2一EGFP—CB2、报告基因质粒pGL4．29[1uc2P／CRE／Hygro]、内参质粒PRL—TK共转染HEK293细胞。

6、采用G418与流式细胞仪筛选GFP阳性细胞，RT-PCR和Westernblot验证GFP阳性细胞中CB2mRNA和蛋白的表达，荧光显微镜观察GFP的表达情况。利用报告基因法进一步筛选稳定表达双荧光素酶报告基因的细胞株。结果：RT-PCR与Westernblot鉴定稳定表达的细胞株中有CB2受体的表达，在荧光显微镜能观察到绿色荧光。通过检测双荧光素酶报告基因筛选出了最高活性比例的细胞株。结论：成功构建了稳定表达CB2与双报告基因的细胞株，为采用报告基因法高通量筛选CB2受体激动剂奠定了基础。第三部分：二型大麻受体激动剂筛选模型的考察及药物的筛选方

7、法：优化激动剂的浓度和作用时间并采用z’因子、信号本底比、信噪比等方法考察模型的稳定性。此外，采用CB2拮抗剂AM630来验证模型的特异性。在此基础上，对100多种中药单体及提取物进行了筛选。结果：在本次建立的双报告基因筛选模型中，给予lgmol／LHU一308，6h后能取得最大相对诱导率。筛选模型Z7因子为0．84，信号本底比为7．45，信噪比为66．65，表现为良好的稳定性。以AM630作用于细胞可使荧光素酶报告基因活性与对照组相比显著增强fP<0．001)，提示模型具有良好的特异性，可用于CB2受体激动剂的筛4猷躞型塑室丝燮茎——选。以该模

8、型进行筛选，发现了两种具有CB2受体激动剂活性的中药单体。结论：该模型稳定可靠且特异性比较强，筛选结果具有一定的可信度。关键词：二型大麻