基于猪ccr1和ccr5受体高通量细胞筛选模型的构建及其条件优化

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1、．＇？－、、＾？，一．々々今－＇—ｒ＾＇；＾心、巧巧分类号一学号Ｍ－；家１２０４８５多．＇．一—、：－、＾．、＇幻巧＼．六：一扛‘巧、＇：勺ｆｃ．．—？？馬＇、Ｘ＜＂＊令Ｖ：辦；寺舒．■、ｉＴ＇：、；乂＾＿；畔＾社媛叫义聲＇＇ＹＡＮＧＺＨＯＵ、ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ本Ｉ二二＿為《ｊ，起戶去孝位＾义－硕＊：＾：心ｙ－戸＂．：（．学术型）＇＾．权４Ｖ：．爲ｒ＇＂－餐％乘葦基于猪＇女ＣＣ民１和ＣＣＲ５受体高通量细胞締选模型的、构建及其条件优化％＾皆每、－

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3、＞．记＊ｘ－化？－．茲挺巧八Ｘ若户己麥－心泛技巧凌占為参巧ｉ■■＾－－＇蠻‘三’－Ｖ八．！：／节扣萬惡直片＞’续：：！！；！今．基于猪ＣＣＲｌ和ＣＣＲ５受体高通量细胞筛选模型的构建及其条件化化ＴｈｅＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｏｒｃｉｎｅＣＣ民１ａｎｄＣＣＲ５－ｕｔＭｏｄｅＲｅｃｅｐｔｏｒｏｆＨｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐＣｅｌｌＳｃｒｅｅｎｉｎｇｌ研究生：柴缠田专业：基础兽医学导师：王志强教授扬州大学兽医学院２０１５年６月柴继田：ＣＣＲｌ和ＣＣＲ５受体

4、高通量细胞筛选模型的构建及其条件优化基于猪１＿基于猪ＣＣＲ１和ＣＣＲ５受体高通量细舱筛选模型的构建及其条件优化中文摘要趋化因子受体１（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｔｏｒ１ＣＣＲ１）和趋化因子受体５（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｔｏｒｐ，ｐ５ＣＣＲ５）属于Ｇ－，蛋白偶联受体家族成员，可由单核细胞、Ｔ细胞、自然杀伤细胞、成纤。研究表明ＣＣＲ５维细胞等分泌，在也脏、脑、呼吸道、生殖器官等均有表达１和ＣＣＲ与其配体作用在机体呼吸道系统、免疫系统、生殖系统和生长发育中均发挥着重要作用。ＣＣＲ１和ＣＣＲ５的共用配体ＲＡＮ

5、ＴＥＳ为ＣＣ型趋化因子，ＲＡＮＴＥＳ在病毒感染时表现活跃，。某些病原影响ＲＡＮＴＥＳ表达的机制也初步被阐明但是在猪方面，关于ＲＡＮＴＥＳ与其受体ＣＣＲ１和ＣＣＲ５作用后，细胞内信号激活情况如何Ｗ及是否能影响某些病毒病的感染过程尚未见报道。为了探巧ＲＡＮＴＥＳ与猪ＣＣＲ１和ＣＣＲ５作用后细胞内信号激活情况，寻找作用ＣＣＲ１或ＣＣＲ５的活性化合物，Ｗ及其是否能在猪传染性疾病中起到作用，本研究通过对猪ＣＣＲ１５ｃ＋－和猪ＣＣＲ进斤分子克隆并构建了真核表达载体，在获得ｐＤＮＡ３．１ｍｃ／ＣＣＲｌ和（）ｙｃＤＮＡ３＋－ｍｐ．１（）ｙｃ／Ｃ

6、ＣＲ５后，分别转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，通过双巧光素酶报告基因法，使用微孔板多功能巧光素酶检测仪检测ＲＡＮＴＥＳ作用后巧光素酪的表达量。根据检测结果选择报告基因与ＣＣＲ－１或ＣＣＲ５转染ＣＨＯＫｌ细胞，使用Ｇ４１８和潮霉素Ｂ加压筛选，通过有限稀释法和单巧光素酶报告系统检测巧光素酶巧光值的变化情况，筛选出稳定表达的－－－ＣＣＲ－１／ＣＲＥＣＨ０Ｋ１和ＣＣＲ５／ＳＲＥＣＨ０Ｋ１单克隆细胞。为了寻找ＣＣＲ１和ＣＣ民５的活性－－－－Ｋ化合物能影响高通量筛选过程中ＣＣＲ１／ＣＲＥＣＨ０Ｋ１和ＣＣＲ５／ＳＲＥＣＨ０１巧光素酶，对表达量的各个条件进

7、行了优化。全文主要成果如下：１、使用ＰＣＲ技术从猪的肌肉组织中扩増出１０６２咕的ＣＣＲ１基因片段和１０５９ｂｐ的ＣＣＲ５基因片段。将猪ＣＣＲ１和ＣＣＲ５基因连接到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１＋饼获得重组（ｃ＋ｃｃ＋－ｍｃ／质粒ｐＤＮＡ３．１ｍ／ＣＣ艮ｌ和ｐＤＮＡ３．１ｙＣＣＲ５。（＞ｙ（）２＋－＋－、将ｃＤＮＡ３．１ｍｃ／ＣＣＲｌ和ｃＤＮＡ３．１ｍｃ／ＣＣＲ５重组质粒转染到ＨＥＫ２９３Ｔｐ（）ｙｐ（）ｙ－ＷｅｓｔｅｒｎＴＰＣＲｂｌｏｔｉｎ细胞中，通过民技术和ｇ技术鉴定目的基因的转录和翻译，结果显示目的基因顺利表达。－

8、－ｍ３、将ｃＤＮＡ３．１＋ｍｃ／ＣＣＲｌ和ＣＤＮＡ３．１ｃ／ＣＣ