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《受体激活剂高通量筛选细胞模型的研究_曹婧.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2008,28(9):61~67技术与方法组胺H3受体激活剂高通量筛选细胞*模型的研究1,2**31,21,21,2曹婧张烨彭志刚李际仙王少鹏(1中国科学院北京基因组研究所北京1013002中国科学院研究生院北京100039)(3上海华大天源生物科技有限公司上海201203)摘要目的:建立基于报告基因的组胺H3受体(H3R)激活剂的高通量筛选模型,用此模型对收集到的中草药化合物组分进行筛选,以发现新的组胺H3R激活剂。方法将H3R基因质粒(H3R/pCDNA3.1-hygro)与报告基因质粒
2、(3XCRE-LUC)按31的比例共转染入HEK293细胞,建立了稳定的H3R配体的报告基因筛选细胞株。激活剂与细胞表面H3R结合后,激活相应的信号通路,调节Forskolin刺激后的报告基因的表达,通过测定荧光素酶报告基因表达水平的变化,评估激活剂影响H3受体的生物活性。结果通过对筛选条件,如激活剂孵育时间、Forskolin终浓度、化合物溶剂的选择、溶剂DMSO终浓度等的优化,建立了可靠的筛选方法。该模型的Z因子可达到05以上,稳定性可保持20代,完全符合高通量筛选需求。利用该细胞模型对多种中草药萃取物进行了筛选,找到了两种对H3R有活性的中药组分。结论建立的细胞模
3、型可以有效的应用于以组胺H3受体为靶点的高通量药物筛选。关键词组胺H3受体(H3R)报告基因Forskolin高通量筛选中图分类号R965.1随着组合化学、微芯片技术和基因组学的发展,高而H2受体则主要控制胃酸的分泌,其拮抗剂也成为[7]通量筛选技术(highthroughputscreening,HTS)应运而主要的治疗胃肠溃疡的药物。随着人类基因组计划生[1]。HTS就是利用药靶的分子或细胞水平的生物学的完成,组胺受体家族两个新成员H3和H4受体分别[8]于1999年和2001年被发现。他们所偶联的G蛋白机制,以微孔板为基础,进行大量筛选,找到能选择性[2]
4、都是Gi。H3受体集中表达在神经元细胞中;H4受体地作用于药靶的有生物活性的化合物。主要表达于造血细胞系中。H3受体一开始是作为一组胺受体是高通量筛选中重要的药靶。H1和种突触前自身受体而存在的,负责调控包括组胺在内[3,4]H2受体发现和研究的较早,它们与后来发现的组多种神经传导递质的释放。后来人们通过基因敲除小胺受体家族成员一样,属于G蛋白偶联受体家族鼠等研究手段,发现H3受体还参与调控包括睡眠、觉[5,6]醒、心功能、胃酸分泌、记忆以及认知在内的多种生理(GPCRs),分别偶联Gs和Gq两种G蛋白。组胺[9]过程。对于与其特异性作用化合物(激动剂或拮抗通过H1受体
5、引起各种过敏反应的发生。因此,H1受剂)的开发,成为了世界各大制药企业研发的新热体的一些拮抗剂一直作为主要的抗过敏的药物销售。[10]点。收稿日期:2008-04-02修回日期:2008-05-20H3受体与Gi蛋白偶联,引起细胞内cAMP水平的*国家自然科学基金资助项目(30572335)降低,所以无法直接检测到低本底水平上荧光素酶报**电子信箱:tutuiyb@163.com告基因表达的变化。我们在实验中使用了腺苷酸环化62中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo.l28No.92008酶激活剂Forskolin,从而升高胞内cAMP水平,增加荧
6、孔,置于37,5%CO2孵箱中孵育18~24h。H3R细光素酶报告基因的表达。这时,激活剂与H3受体结胞株:将H3R质粒和报告基因质粒以31的比例共转合,会抑制腺苷酸环化酶的活性,降低Forskolin所引起染HEK293细胞株,转染试剂为lipofectamine2000,24h的荧光素酶报告基因表达的水平。后分别以120和140的比例接种到100mm培养皿中本实验室建立了一个以H3受体为靶点的高通量培养,隔天加抗生素100g/mlHygromycin和800g/ml筛选模型。利用H3R内源性激动剂Histamine对筛选G418筛选,10天左右挑克隆到9
7、6孔板培养,扩大培养条件进行了摸索和优化,并利用我们已有的源于中草到24孔板后,按每孔100l的量接种于96孔培养板,4药的天然产物库进行了小规模筛选试验,得到了满意密度为每孔310个,孵育过夜。用CRE的激活剂的结果。Forskolin和H3R内源性激活剂Histamine检测荧光素酶的表达,选取荧光素酶表达量之比(Forskolin/1材料与方法Forskolin+Histamine)最高的单克隆。筛选出的单克1.1药品与试剂隆继续扩大培养,进行进一步的鉴定和验证。每当细TMBrightGloLu
