桑叶中pparγ激动剂活性组分的分离和筛选

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1、望型望坠￡整量亟主蔓生堕至王————————————一!；!±史．!坠垦芏堑塾型煎丝塑坌塑坌壹i!堕垄万方数据浙江理工大学学位论文独创性声明学位论文作者签名：客始签字日期：埘年歹月巧日㈨谳馈踺锇船一一一一一一谚及●虱甩均崩倾玳砘钢艄万方数据学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解逝婆堡王盔鲎有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权渔延理王盔堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：缮炙墟签字日期：捌拜歹月玎日

2、导师签名：签字日期：万方数据桑叶巾PPARy激动剂活性组分的分离和筛选本研究由“重大新药创制"科技重大专项(No．2012ZX09102301)，国家高技术研究发展“863"项目(NO．2011AAl00603)提供资助万方数据浙江理工大学硕士学位论文中义全称英文缩写英文全称过氧化物酶体增殖因子活化受体vPPARy桑叶中PPARY激动剂活性组分的分离和筛选缩略语PeroxisomeproliferatoI．_actiVatedreceptorY四倍重复的过氧化物酶体增殖物的反应元件PPRE4氨苄青霉素Amp胎牛血清FBS卡那霉素Peroxisomeproliferatorrespon

3、siveelement4AmpicillinFetalcalfserumKanKanamycin二甲基亚砜DMS0气相．质谱联用GC．MS液相一质谱联用I，C—MSDimethylsulfoxideChromatography—MassSpectrometryLiquidChromatograph—MassSpectrometer美国国家生物信息技术中心NCBINationalcenterforbiotechnologyinformation万方数据浙江理工大学硕士学位论文桑叶中PPARv激动剂活性组分的分离和筛选摘要糖尿病是一种代谢性疾病，它的主要特点是高血糖。糖尿病患者长期存在高

4、血糖，会使各种组织器官，尤其是眼、肾脏、心脏、血管、神经等功能的慢性损害。桑叶具有良好的治疗糖尿病效果，我国是产桑大国，桑叶中提取的提取物质，如总多糖，黄酮和生物碱的抗血糖功能被广泛的研究，而桑叶也常与其他中药配伍治疗糖尿病。PPAR丫是核受体超家族成员，PPARy激活后通过相关调节可以促进脂联素分泌，增加机体对胰岛素的敏感性。通过PPARy{言号通路，改善胰岛素抵抗，是目前人们研究抗糖药物的一种有效途径。PPA脚与激活剂结合后被激活，会和P,_XR形成异源二聚体，与靶基因启动子上游的反应元件PPRE结合，调控荧光素酶报告基冈的表达水平。本研究利用这个原理，旨在建立一种简单、高效、灵

5、敏的高通量筛选PPAR丫配体的Cos一7细胞模型，并运用于桑叶中的小分子活性物质的筛选。本研究构建重组表达载体pEGFP．N2．PPA脚，pGL4．PPRE4．1uc。利用lipofectamine2000，采用共转染的方式将两个质粒转入细胞，并对细胞模型进行优化处理，最终选定细胞汇合度为70％，pEGFP—N2一PPARy与pGL4．PPRE4．1uc的质粒浓度比为2：l，转染时间为20h，药物孵育时间为24h。利用PPAR丫阳性配体罗格列酮检测模型的稳定性和特异性，结果显示模型的稳定性良好，且仅对罗格列酮有激活效应并在一定范围内呈剂量效应关系，而对其他配体没有激活效应。通过以上验

6、证证明PPARY配体高通量筛选细胞模型已经成构建，可用于桑叶中小分子活性物质的初步筛选。本研究利用正己烷粗提桑叶中的有效成分，运用硅胶柱层析和薄层层析初步分离正己烷初提物，得到Fr．PE．1到Fr．PE一40四十个分离样品。利用Cos．7细胞模型，检测40个组分的活性，发现其中6个组分活性较好。将6个组分进行碱法衍生，并用GC—MS分析组分的脂肪酸构成。通过检测，我们共从桑叶中获得18种脂肪酸。将脂肪酸用Cos．7细胞模型分析，结果显示十四酸，十五酸，亚麻酸均有PPA脚激活作用，其他脂肪酸均无作用。其中当十四酸的浓度为100j．tmol／L、十五酸浓度为50gmol／L、弧麻酸浓度为

7、150lumol／L、亚油酸浓度为100gmol／L时，其激活倍数达到最大，分别为l，5l倍、2．12倍、2．48倍和2．21倍。万方数据浙江理工大学硕士学位论文桑叶中PPARy激动剂活性组分的分离和筛选利用标准品绘制标准曲线，发现干燥桑叶中亚麻酸占1．91％，亚油酸占0．94％，十四酸占0．1l％。桑叶rfl的PPAR丫活性激动剂的分离和筛选为寻找新的天然的胰岛素增敏剂，合成新型PPAR7激动剂提供了依据，同时为开发我国天然药物的研究提供了参考。关键词：