mir-612对肝癌细胞干性的调节作用及其机制

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1、万方数据论文题目miR一612对肝癌细胞干性的调节作用及其机制TheregulatoryroleanditsmechanismofmiR一612onthestemnessofhepatocellularcarcinoma指导教师：吴伟忠教授导师组成员：王鲁教授本课题由国家自然科学基金项目(81272437)和上海市科委课题(11140902501，12140901700)联合资助万方数据目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯第一部分miR．612对肝癌细胞干性的调节作用材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25第二部分miR．612调节肝癌细胞干性的分子机制材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯28结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43不足与后续研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44附录⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53论文声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54万方数据复旦大学硕士学位论文中文摘要背景与目的：肿瘤干细胞概念的提出至今已经有30年左右的时间。1997年Bonnet和Dick在对急性髓性白血病(AML)研究中发现，从AML患者体内分离获得的特定亚群肿瘤细胞种植到NOD／SCID小鼠后可以导致人类样白血病。之后，在多种实体肿瘤，如乳腺癌，脑肿瘤，肺癌，前列腺

5、癌，黑色素瘤，卵巢癌，结肠癌，头颈部肿瘤，胰腺癌，肝癌，膀胱癌和皮肤癌中陆续分离出各自的肿瘤干细胞。肿瘤干细胞具有不断自我更新、抗凋亡和耐药等特性。近年来的研究表明肿瘤干细胞不仅在肿瘤的起始和生长中起重要作用，肿瘤干细胞在肿瘤转移中的也具有重要的作用。目前的研究提示EMT对肿瘤细胞的干性调控起着非常重要的作用，两者在信号通路上存在着交互现象。研究发现肿瘤干细胞的形成受到多层次基因的调节，其中microRNA表达异常与肿瘤细胞EMT及肿瘤干细胞的形成密切相关。前期研究提示miR．612通过抑制EMT过

6、程从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。所以本研究旨在前期工作的基础上进一步观察miR．612对肝癌细胞的干性是否具有调节作用以及其对肝癌侵袭前沿的调节作用，最后探讨miR．612参与调节肝癌细胞干性的可能作用机制。方法：本实验以肝癌细胞系MHCCLM3(相对低miR．612)和HepG2(相对高miR．612)为研究对象。首先采用瞬时转染miRIDINAmimic和hairpininhibitor的方法实现miR．612在MHCCLM3中的过表达(miR．612．O)以及在HepG2中的封闭表达(m

7、iR．612．i)，将上述处理的细胞进行肿瘤球和软琼脂克隆培养；采用慢病毒感染肿瘤细胞的方法实现miR．612在MHCCLM3和HepG2中的稳定过表达(miR．612．O)以及稳定敲低表达(miR．612．i)，将上述处理的细胞进行体外细胞毒实验以及注射到NOD／SCID小鼠皮下进行成瘤性分析；将miR-612稳定过表达的MHCCr或(带绿色荧光)和．稳定敲tCLM3HepG2miR612低表达的同种细胞等细胞数混匀打在裸鼠皮下以观察miR．612在肝癌侵袭前沿中的作用。最后通过Westemblo

8、t、Real．timePCR、免疫细胞荧光及Luciffrasereporterassays等方法探讨miR．612对Wnt／B．catenin信号通路的调节作用。结果：1)MiR．612mimic瞬时转染能够显著抑制HCCLM3细胞的悬浮肿瘤球形成能力和软琼脂克隆形成能力；而miR．612hairpininhibitor封闭能够增强HepG2细胞的悬浮肿瘤球形成能力和软琼脂克隆形成能力。2)miR．612稳定上调的HCCLM3细胞在体外细胞毒实验中体现出对化疗药物(