鸡传染性支气管炎病毒的分离及其s1基因重组5型腺病毒的构建

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1、IsolationofInfectiOUSBronchitisVirusancIUonstruCtlon0tRecomDlnant1—一J■n1■、l●1HumanAdenovirusType5ExpressingS1GeneT1。submittedt011esls19mlttetOlQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—MasterofAgronomy、一=IVSongFei·—fei(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)S

2、upervisors：Prof．ZhangLe—cuiProf．HuRong—liangQingdao，ChinaJune，2012独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：仂钾2年]月2El关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文

3、的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：矶J2年1月2日刷磁辄缘乐年帅一衅”砷鸡传染性支气管炎病毒的分离及其S1基因重组人5型腺病毒的构建摘要鸡传染性支气管炎(InfectiousBronchitis，IB)是由冠状病毒科(Coronavirdae)冠状病毒属(Coronavirus)传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，

4、给养禽业造成重大损失。鸡传染性支气管炎在免疫鸡群中的频繁暴发，给该病的免疫防控带来了极大的困难。本研究通过病毒形态观察、致鸡胚矮小化试验、血凝试验等分离获得1株鸡传染性支气管炎病毒，命名为QSlO株。利用RT-PCR对其S、N基因进行了扩增和序列分析，并绘制了S1基因核苷酸序列系统进化树。结果显示，QSlO在电镜下呈直径80～120nm的圆形粒子，接种鸡胚100％出现侏儒胚和死亡胚，血凝效价为1：1024，EID50为107’弱／0．2ml，该分离毒株与中国常用疫苗毒株、国内流行毒株亲缘关系均较远，而与澳大利亚流行毒株S1基因的核苷酸序列同源性达91．4％～99．6％，推测该毒株与澳

5、大利亚流行毒株可能具有相同的进化来源。参照QSIO株S1基因的全序列设计一对引物，通过RT-PCR克隆至t]S1基因，将其连接至pUCl9载体，测序鉴定正确后，利用胁玎饥II和B以，枷双酶切将Sl基因从重组克隆质粒上切下，连接至相同酶切处理的腺病毒穿梭质粒载体pacAd5CMVK．NpA中，酶切及测序鉴定重组穿梭质粒命名为pacAd5CMV-S1。利用限制性内切酶PacI将上述构建好的重组穿梭质粒线性化，与同样利用PacI酶切线性化并回收的腺病毒骨架质粒pacAd59．2．100共同转染人胚胎’肾HEK293AD细胞系，在HEK293AD细胞中完成同源重组，并包装出携带S1基因的重组

6、人5型腺病毒，命名为tAd5．S1，另外，利用线性化的pacAd5CMVK-NpA和pacAd59．2．100重组获得的腺病毒命名为wt．rAd5；4-9代传代后，各个重组病毒的培养滴度都能达至1]107TCID50。获得重组病毒后，对其进行电镜观察表明获得的病毒具有典型的腺病毒形态；用重组腺病毒感染HEK293AD细胞，提取细胞总RNA，通过RT-PCR，在转录水平上证明了重组腺病毒能够介导靶基因在真核细胞中表达；最后，对感染重组病毒后的HEK293AD细胞做间接免疫荧光染色和细胞总蛋白做Westem．blot检测，结果在蛋白水平上证明了靶基因在被感染细胞中的表达。综上所述，本研究

7、从病死鸡的腺胃组织中分离到一株与澳大利亚流行毒株可能具有相同进化来源的鸡传染性支气管炎病毒，命名为QSIO株；以该分离毒株的S1基因为靶基因，成功构建了介导表达QSlO株S1蛋白的复制缺陷性人5型腺病毒，并在形态学和分子生物学两方面对该重组腺病毒进行了鉴定，为研究安全高效的IBV重组腺病毒疫苗奠定了基础。关键词：鸡传染性支气管炎病毒；分离；Sl基因；重组腺病毒；构建青岛农业大学硕士学位论文IsolationofInfectiousBronchitisVir