苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及高毒力菌株的研究

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1、河北农业大学硕士学位论文苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及高毒力菌株的研究姓名：苏俊平申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：王勤英20120526摘要苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)是一种可以形成芽胞和晶体蛋白的革兰氏阳性细菌，属于芽胞杆菌属，在自然界中分布广泛，很多高毒力或具有特异杀虫活性的新菌株不断被发现。本论文围绕苏云金芽胞杆菌新菌株的筛选、鉴定、评价及杀虫基因克隆等方面开展了一系列的研究，主要结果如下：1．从河北省、内蒙古及吉林省等不同地区共采集367份土样，利用醋酸钠．抗生素筛选法并结合复红染色分离鉴定苏云金芽胞杆菌，

2、共得到75株Bt菌株，出菌率为12．27％。这75株野生菌株的伴胞晶体有菱形、球形、米粒形和不规则形等。2．PCR．RFLP基因型分析结果表明，这75株Bt菌含有cryl、crylAcry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry8N,cry9、cryl3-14、cryl8、cry22、c，y2每28、cry34—35、cyt2和vfp3A18种基因型。其中cry2基因含量最高，占总菌株数的43．24％，crylI基因位居第二，占36．49％。还有12株菌未鉴定出基因型。3．通过生物测定，发现了菌株L-2、L．10、L．13、L．17、L．22

3、、SC．39和SC．40对二点委夜蛾(Athetislepigone)的幼虫均表现出较高的杀虫活性，基因型分析表明这些菌株均同时含有crylAc、cry2Ac、crylI、vip3A这四种杀虫基因，初步证实crylAc是对二点委夜蛾起主要作用的基因。4．BtYX．1菌株对梨小食心虫(Grapholitamolesta)、苹小卷叶蛾(Adoxoph)，esorana)、苹掌舟蛾(Phaleraflavescens)苹果蠹蛾(Cydiapomonella)、美国白蛾(Hyphantriacunea)、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、斜纹夜蛾(Prodenia

4、limra)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)以及小菜蛾(Plutellaxylostella)等果树及蔬菜害虫表现出广谱杀虫活性，BtYX．1菌株对这些害虫幼虫的毒力均高于BtHD．1菌株。BtYX．1菌株产生菱形伴胞晶体；SDS．PAGE分析表明该菌株表达的主要蛋白条带分子量约为130kDa和60kDa；基因型鉴定表明，BtYX．1菌株含有crylAc、cry2Ac、crylI、cry34—35和vip3Aa基因。BtYX一1的最佳培养基配方为：黄豆饼粉32∥L、花生饼粉30∥L、鱼粉16∥L、蛋白胨69

5、／L、玉米粉18∥L、酵母粉69／L、蔗糖lg／L、MgS04·7HzO0．29／L、KH2P04lg／L、CaC030．Sg／L、FeS04·7H200．069／L、余者用水补足。5．L．27菌株产生球形伴胞晶体，SDS．PAGE检测显示主要表达130kDa和60kDa的蛋白，基因型分析表明该菌株含有cry8、cry8N,cry22、倒2乒船基因。利用PCR方法从菌株L-27中分离克隆了cry8的全长基因。序列分析显示，cry8全长基因含有3525个碱基，编码由1175个氨基酸组成的蛋白质。通过在NCBI上应用BLAST软件比较相似性显示，与已发表的登录号为AY5510

6、93．1的cryS基因同源性达99％，已提交GenBank登记，登录号为JQ389477。该基因已被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Fa3。关键词：苏云金芽胞杆菌；PCR-RFLP：杀虫活性；基因克隆；cry8Fa3IsolationandIdentificationofBacillusthuringiensisandResearchofHighToxicityStrainsMastercandidate：SuJunpingSupervisor：ProfessorWangQin徊gMajor：AgriculturalInsectandPestControl4bst

7、raetBacillusthuringiensis(Bt)isaubiquitousgram—positivebacterium．Itsactivityisattributedlargelytotheinsecticidalcrystalproteins(InsecticidalCrystalProteins，ICPs)whicharealsocalledaSdelta-endotoxin．Isolation，identificationandevaluationofnewB．thuringiensisstrainswerep