苏云金芽胞杆菌HD12菌株中cry基因的表达调控.pdf

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3、Universitycode：10223Classifiedcode：Q93Graduatenumber：XS139006Confidentialdegree：PublicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationRegulationandExpressionofcrygenesinBacillusthuringiensisHD12Postgraduate：SongZhiruSupervisor：ProfessorSunDongmeiProfessorSongF

4、upingMajor：MicrobiologyMicrobialResourcesandResearchdirection：UtilizationCollegeofLifeScienceCollege：andTechnologyDaqingChinaJune,2016摘要苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性细菌。其在形成芽胞的同时会产生由杀虫蛋白组成的伴胞晶体，主要由cry和cyt基因编码。在目前的应用中，Bt菌剂存在着毒力有限、杀虫谱较专一、害虫容易产生抗性等问题

5、。在遗传工程菌的构建过程中，多种杀虫基因的协同表达十分重要。本实验室B．thuringiensissubsp.morrisonistrainHD12菌株含有多个杀虫蛋白，主要对鳞翅目害虫具有毒性，前期的二代测序获得基因组序列，分析其发现含有8个cry基因，符合多基因表达调控的研究。本研究利用蔗糖梯度离心法纯化HD12菌株晶体蛋白，通过SDS-PAGE和LC-MS/MS对晶体蛋白进行鉴定，确定HD12晶体中含有Cry1Da、Cry1Ae、Cry1Bb、Cry1Fb、Cry1Ja五个蛋白。同时通过在不同遗传背景的菌株中检测cry1Da、

6、cry1Ae、cry1Bb、cry1Fb、cry1Ja启动子的β-半乳糖苷酶活性，确定cry1Da基因的转录是受SigE控制，其它的四个基因的转录是受SigE、SigK控制。其中cry1Ja和cry1Fb基因启动子活性是最高的。选取cry1Ja和cry1Fb基因启动子来分别指导Cry1Ac和Cry2Ab蛋白表达。通过SDS-PAGE分析和质谱鉴定确定cry1Ja、cry1Fb基因启动子均可指导Cry1Ac、Cry2Ab蛋白正确表达。成功构建了具有相同转录机制的两个不同的启动子指导多个外源cry基因的表达菌株。本研究确定了相同转录机制

7、的启动子能够直接指导不同的cry基因在一个菌株中表达。这对克服当前Bt杀虫剂应用限制，构建多基因表达的菌株具有重要价值。为Bt菌株中表达多种依赖相同调控机制的cry基因提供了新思路。关键词：苏云金芽胞杆菌；cry基因；cry基因启动子；表达菌株IAbstractBacillusthuringiensis(Bt)isaGram-positivebacteriumthatwidelyspreadinnature.Itcanbeproducetheparasporalcrystalwhichconsistofinsecticidalpro

8、teinsduringsporulation.Theinsecticidalcrystalproteinisencodedbycrygenesorcytgenes.TheapplicationofB.thuringiensispest