苏云金芽胞杆菌vip3A基因的研究

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1、中山大学博士学位论文苏云金芽胞杆菌vip3A基因的研究姓名：陈建武申请学位级别：博士专业：微生物学指导教师：庞义2003.6.5苏云金芽胞杆菌vip3a基因的研究摘要营养期杀虫蛋白(vegetativeinsecticidalproteins，VlPs)是苏云金芽胞杆菌(BaciHusthuringiensis，at)在对数生长中期分泌的一类新型杀虫毒蛋白，它对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性。Vip3A通过诱发细胞凋亡，最终导致昆虫死亡，这种作用机理与Bt杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins，ICP

2、s)的作用机理完全不同。本文对本实验室保存的菌株进行v咖鲥基因的检测，克隆了其中2个v／p3A基因并在大肠杆菌中得到高效表达。通过信号肽缺失实验研究了在大肠杆菌和Bt中Vip3A蛋白的信号肽功能。用ICPs基因的启动子和Shine-DalgarnofSD)序列对vf『p3A基因的相应序列进行替换或连接以改变其表达时相和提高表达量，可用于构建了新型高效的Bt工程菌。，f用PCR方法从本实验室保存的菌株中筛选到39株即约25％菌株含有vf『p3A基L因。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株，即S184和611，分别

3、进行v枷鲥基因的克隆和测序，再已报道的其它8个vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较，结果表明，vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个v驴鲥基因分别插入表达载体pQE30，构建了重组表达质粒pOTP-S184和pOTP．611，将这两个质粒转化到大肠杆菌M15，经lmmol／LIPTG诱导后均表达89kDa大小的Vip3A蛋白。将Vip3A--S184和Vip3A-611蛋白对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、斜纹夜蛾假矗tura)和棉铃虫(Helicoverpaarmigera)等3种害虫的2龄幼虫进行

4、生物测定，结果表明，2个Vip3A蛋白对以上3种夜蛾科幼虫均具有较高的杀虫活性但它们的毒力没有显著性差异，这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。蛋白可溶性试验表明，目的蛋白Vip3A-S184中约有19．2％是可溶的，透射电镜观察到大多数蛋白是以包含体形式存在的。因此，可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化，并将纯化的蛋白对家兔进行免疫而制备多克隆抗体。利用Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析，发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89kDa大小的蛋白，其中有4株检

5、测不到Vip3A蛋自。叛本实验梭建鹃重组凄粒pTvip3A-S184为模板进行PCR扩增势克隧了靛失信号默缡码辍的vip3AAN基爨，播入表达载体pQE30褥到鬟缝表达袋粒pDTP并转入大强抒蘩M15遴孳亍表达。毙较了Vip3A帮Vip3AAN蛋自静可溶牲、包含体形成位饕纛杀虫溪惶等。研究表明，在蛋白胃溶牲方瑟，与Vip3A蛋自不同静是，Vip3AAN蟹鑫来嚣存《溶幢蛋鑫条带；在M15[pOTP]蔼体串Vip3A蛋鑫惫会体在魏膜阁豫彩残，与之据反，在M15[pDTP]蔼髂串Vip3AAN蛋岛包含体在细瓣震中形成；vip3A矗N包含

6、体及萁裂瓣滚对甜菜夜簸帮斜绞夜蛾都没有任何毒力，Vip3A蛋自豹包含俸对戬主害虫也没有毒力两冀裂解滚辩这两种幼虫淘显示较高静杀虫添性。结采表疆了，在大肠秆萤牵Vip3A蛋崮静N端信号获对于vip3A蛋自静掰溶性及其杀虫活性蔡青霾要俸焉。分羽输建含有企长vip3A基溺(命名为螂哼8移稻缺失信号驭编码区的v≯j艿鲥s鏊阂的重缀表这质粒pHPT3和pHPAS，并电激转亿Bt晶体缺鹃墅菌株Cry-B褥蓟重缀菌株Cry'B[pHPT3]和Cry'B[pHPaS]。院较了Vipl84蛋自和Vipl84AS蛋自的表达时相、分泌往和杀虫活性等。研

7、究表明，二者表达堂的商峰期都是在14h；Vipl84蛋囱可蔽在菌体和上清液中检测到，而Vipl84AS蛋臼只能在菌体中检测判餐在上清液中检测不到，这说明了Vipl84蛋自是分泌骚自而Vipl84AS蛋白是不分泌副胞井的；Cry'B[pHPAS]的上清液、菌体和浓缩的上清液对甜菜夜蛾和斜纹夜峨均无杀虫活性，而Cry-B[pHPT3】除了上清液无效外，其菌体和浓缩的上清液对以上2种害虫均显永较高杀呶活性。Vipl84蛋白对甜菜夜蛾的LC50为0．74pg／mL，对斜纹夜蛾的LCso为0．08lxg／mL。以上结果表明，在Bt中Vip3

8、A蛋白的信号觖对于Vip3A摄自的分泌和毒力的发挥是必须的。壳隆了不同类型ICPs基因(cry3A、crylA和刚删)的启动子和sD序列并进行序列分析。利用不同类型ICPs基因的启动予和SD序列对v_fpl84基因的相应序列进行替换，彳舄到黧组袭达