新型苏云金芽胞杆菌基因的分离、筛选及其杀虫特性研究

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1、精选公文范文管理资料新型苏云金芽胞杆菌基因的分离、筛选及其杀虫特性研究　　几十年以前人们已经开始利用微生物来控制害虫。苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）是一种独特的细菌，它与许多化合物一起用于防治害虫，并且已经商业化，对农业和环境有重要贡献。尽管其它细菌，包括乳状芽胞杆菌（Bacilluspopilliae）和球形芽胞杆菌（Bacillussphaericus），也用作微生物杀虫剂，但是它们的杀虫活性谱与Bt相比十分有限。重要的是，Bt对人类是安全的，也是世界上应用最

2、广泛的环境友好型生物杀虫剂。Bt杀虫基因已经转化到几种主要的作物中，获得了抗虫的转基因植物，进而提供了农业遗传工程模型。　　第9[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料版的《伯杰氏细菌鉴定手册》将其归属于第二类第十八群，革兰氏阳性，芽胞杆菌属的一个种。　　Cry1类杀虫晶体蛋白对多种鳞翅目害虫具有高效的杀虫活性，是Bt杀虫晶体蛋白中研究最为深入的一类，目前杀虫晶体蛋白的作用方式主要是通过Cry1类蛋白进行研究的。随着cry1类基因在杀虫工程菌和转基因抗虫植物中的广泛应用，抗Bt毒素的昆虫

3、已经出现，由于这一威胁，人们希望得到能同时作用在同一害虫上的不同种类的Bt蛋白。由于Cry2Aa蛋白对鳞翅目和双翅目都有活性，所以对Cry1类蛋白产生抗性的昆虫，Cry2Aa蛋白对其也有活性。　　Cry2Aa与Cry1Aa的氨基酸序列同源性只有20%。　　然而这两种蛋白的三维空间结构非常相似。这说明Cry2Aa蛋白的杀虫机制和许多其它Cry蛋白的杀虫机制相似。所以应用Cry2Aa来减缓抗性昆虫的出现是有价值的。人们已经提出交替使用Cry1A类和Cry2A类蛋白来解决抗性问题。长期以来，新型Bt基因的分离

4、、筛选以及培育转Bt[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料杀虫基因植物，一直是世界上众多国家研究的热点。因此充分发掘我国Bt杀虫基因资源已经成为一项极有价值的工作。为此，本研究从土壤中分离Bt菌株并筛选和克隆杀虫基因，以期获得具有较高杀虫活性的新型cry1类和cry2类基因。　　1、材料与方法　　1.1材料　　1.1.1菌株与质粒本研究涉及的菌株和质粒见表1。　　1.1.2培养基液体LB培养基：1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.0%氯化钠，pH7.0。固体LB培养基：在液体LB

5、培养基中加1.3%琼脂。固体1/2LB培养基：1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.0%氯化钠、1.3%琼脂，pH7.0。　　1.1.3试剂限制性内切酶及连接酶、Pfu购自GiBcol、TaKaRa公司。dNTP、Taq酶等购自上海生工生物工程公司。分析纯化学试剂均为市售。　　1.1.4试虫小菜蛾（Plutella[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料xylostella）、棉铃虫（Helicoverpaarmigera）和亚洲玉米螟（Ostriniafurna-calis）来自中

6、国农科院植物保护研究所提供的标准化试虫。　　1.1.5PCR扩增引物鉴定引物与全长引物均由上海生工合成。引物序列见表2。　　1.2方法　　1.2.1晶体形态观察将Bt菌株V4在1/2LB培养基上培养48h后，将胞晶混合液滴于载玻片上，涂抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色3min，清水冲洗，100×油镜进行镜检，石炭酸复红染液配制方法参见文献［11］。显微镜下观察晶体释放后，刮取培养物100mg用灭菌蒸馏水洗3-4遍，悬浮于1mL无菌水中，将芽胞和晶体混合液滴于玻璃片上，待其干燥，经锇酸固定后酒精梯度脱

7、水，临界点干燥，离子溅射喷金（2nm），HITACHIS-3400N扫描电镜观察拍照。　　1.2.2cry1Ea基因和cry2Aa基因的鉴定及测序[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料参照宋福平等方法，通过cry1类全长通用引物L5un3/L3un3、cry2类半长通用引物S5un2/S3un2，以Bt菌株V4基因组为模板，利用Taq聚合酶进行PCR扩增，PCR反应体系为模板1μL，引物对各1μL，2×Taqmix10μL，ddH2O补至20μL。PCR反应程序：94℃8min；94℃

8、1min53℃1min，72℃4min，30个循环；最后72℃延伸10min。获得的cry1类PCR产物进行PCR-RFLP酶切分析，随后将PCR产物回收与pMD19-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，筛选出阳性转化子，送于上海生工测序。按照已经发表的cry2Aa基因序列，参照文献设计了扩增全长cry2Aa开放阅读框的引物Q2AaF/Q2AaR，并进行cry2Aa全长基因的扩增，引物序列见表2。　　1.2.3cry1Ea和cr