苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究

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1、河北农业大学博士学位论文苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究姓名：宋萍申请学位级别：博士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：王勤英20120526摘要苏云金芽胞杆菌(Bt)是世界上研究最多应用范围最广的杀虫微生物，杀虫活性物质包括Cry和C弘两大类蛋白，在害虫生物防治中发挥了重要作用，但是也暴露了一些弊端，如杀虫谱窄、昆虫易产生抗性等问题，所以进一步分离特异活性或者高活性的野生菌株，鉴定其基因型，为害虫防治提供更多的基因资源。本论文针对含有cry7类基因的苏云金芽胞杆菌野生

2、菌株进行了鉴定和评价，从中筛选出了对马铃薯二十八星瓢虫特异活性的新菌株，针对这一新菌株生物学特性、蛋白型、基因型以及作用机理等方面进行了一系列的研究，主要内容和结果如下。1．利用醋酸钠筛选法并经基因型分析，从河北省土壤中分离筛选出了56株含有cry7基因的Bt菌株。在这些菌株中，10株菌同时含有cry7基因和其他cry基因，46株菌只含有单一cry7基因。大部分Bt菌株表达130kDa蛋白，仅有BQZ．12菌株产生80kDa和70kDa蛋白，BQZ．8菌株产生130kDa和80kDa蛋白。通过生

3、物活性测定得到一株对马铃薯二十八星瓢虫幼虫具有特异杀虫活性野生菌BtWZ．9。2．WZ．9菌株在胞晶分离期产生菱形伴胞晶体，蛋白分子量为130kDa，对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫的LC50值为0．209mg／mL。基因型鉴定结果表明该茵只含有单一的cry7基因，序列分析显示该基因与cry7Abl同源性达到99％，被Bt命名委员会命名为cry7Ab3(登录号ABX24522)。3．为了明确Cry7Ab3蛋白的杀虫活性，从BtWZ．9菌株中克隆了cryTAb3基因，该基因在大肠杆菌BL21和Bt无晶

4、体突变株HD73cry"中都能正确表达130kDa蛋白，其表达产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫都具有较高毒力，LC50值分别为0．460mg／mL和0．205mg／mL，cry7Ab3基因在转Bt无晶体突变株HD73．Cry7Ab3中形成的晶体(0．86gmX1．23lam)比野生菌产生的晶体(0．73l_tm×1．009m)略大一些。这些结果证实了cryTAb3基因编码蛋白发挥杀虫作用。4．为明确Cry7Ab3蛋白最短活性区序列，利用特异性引物分别克隆表达不同长度的cry7Ab3基因片段，Ec

5、oliCry7Ab3一l(Metl．Phe657)、EcoliCry7Ab3—2(Metl—Phe626)、EcoilCry7Ab3—3(Asn30一Phe657)和EcoliCry7Ab3-4(Lys87．Phe657)，并测定了表达产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫的毒力。结果表明EcoliCry7Ab3．1表达的75kDa蛋白毒力最高，LC50值为O．114mg／mL，可以确定Metl．Phe657为Cry7Ab3蛋白的最短活性区。5．分别利用胰蛋白酶和马铃薯二十八星瓢虫中肠蛋白酶液体外酶解

6、130kDa的Cry7Ab3原毒素(质量比为100：1)，均得到75kDa的酶解产物。与相同浓度的原毒素相比，75kDa的酶解产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫具有较高杀虫毒力。对马铃薯二十八星瓢虫幼虫中肠组织病理学研究表明，3龄幼虫取食Cry7Ab3原毒素蛋白3d后，中肠细胞严重破坏，细胞间出现明显孔洞，幼虫表现出活动缓慢，取食量下降的现象。取食5d后，中肠组织完全被破坏，幼虫开始死亡。通过Ligandblotting技术，检测到马铃薯二十八星瓢虫中肠BBMV上存在分子量为220kDa的Cry7

7、Ab3毒素结合受体，经质谱分析鉴定该受体蛋白为钙粘蛋白。本论文创新之处在于发现了对马铃薯二十八星瓢虫幼虫特异活性的Cry7Ab3蛋白，构建了转cry7Ab3基因的Bt工程菌，明确了Cry7Ab3蛋白最短活性区为75kDa的Metl．Phe657蛋白片段以及Cry7Ab3毒素的作用靶标是马铃薯二十八星瓢虫幼虫中肠组织上的BBMV，初步确定了其在中肠BBMV上结合蛋白可能是钙粘蛋白。这些研究结果为更好地应用Cry7Ab3蛋白防治马铃薯二十八星瓢虫提供了理论基础。关键词：苏云金芽胞杆菌；Cry7Ab3

8、蛋白；马铃薯二十八星瓢虫；最短活性区；作用机理IsolationandIdentificationofBacillus胁Ⅳ咖咖矗§andCharacterizationtheBtstrainagainstHenosepilachnavigintioctomaculataCandidate：PingSongAdvisor：．Prof．Qin徊gWangSpeciality：．AgriculturalInsectandPestControlAbstractBacillusthuringiensisi