牛传染性鼻气管炎病毒ee基因表达与针对gb基因shrna抑制ibrv的体外增殖研究

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1、ExpressionoflnfectiousBovineRhinotracheitisVirusGlycoproteinEandRNAInterfe：renceAgainstIBIWgBGeneThesisR1】bmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfbrtheDegreeofMasterofAgronomy一FengBaohai(DepartmentofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：LiuHuanqiSongLinglingQingDa

2、o．China学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。学位论文作者签名：?马宝淘签字日期见。I墀7月z．-日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等

3、复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：歹马皇蠕签字日期：伽＼2年一7月2jj导师签字：三芜巧埃缮秀／／签字日期：卿．纷功，壹璺壅些太堂亟±堂焦监塞煎璧牛传染性鼻气管炎病毒萨基因表达与针对驴基因shRNA抑制lBRV的体外增殖研究摘要牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisvirus，IBRV)引起的牛的急性、热性和接触性传染病。该病临床上主要表现为高热、呼吸困难、鼻炎和上呼吸道炎症以及母牛流产、死胎等症状。目前，

4、在国内主要依赖价格昂贵的试剂盒检测IBR，尚缺乏能够广泛应用的商品化的诊断试剂，所以需要开发能准确诊断IBR的产品和治疗方法。．萨编码的糖蛋白属于一种典型的跨膜糖蛋白，妲糖蛋白的胞外区暴露在病毒粒子的表面，是动物机体免疫细胞识别的靶抗原。本研究第一部分构建了牛传染性鼻气管炎病毒IBRVgE基因原核重组载体，并将重组蛋白纯化后作为包被抗原简单检测了抗原的效价，所表达的蛋白具有良好的免疫原性，可用于IBRV诊断试剂和亚单位疫苗的研究。试验依据IBRV全基因组序列设计引物，克隆舾基因，可见约1729bp的特异条带，测序鉴定正确后添加酶切位点，酶切连接构建原核表达载体peET32a-gE，并利用www

5、．expasy．org／cgi—bin／protparam、TMHMM在线服务器、BioEdit、DNAStar等工具对重组蛋白的氨基酸序列、抗原性、水溶性和表面可及兴等基本性质进行分析。经5％dPTG诱导6h表达。SDS—PAGE电泳结果表明，表达产物以包涵体的形式存在。融合蛋白大小约为87，000，与预测值相符。利用Ni层析柱纯化重组蛋白，并用Western．blot鉴定纯化的重组蛋白浓度为0．4mg／ml(0，123A)。ELISA检测证明纯化后的重组蛋白具有良好的免疫原性，考马斯亮蓝法测抗体效价为1：3200，为IBRV新鉴定方法的建立奠定了基础。妒基因是IBRV保守性最高的基因，一般

6、作为PCR鉴定的主要目的片段。。魑是病毒复制的必需因子，也是IBRV刺激宿主免疫应答的主要抗原蛋白。因此作为本研究的靶向基因。RNAi技术是一种新的鉴定基因功能、制造抗病毒药物的方法。能够有效减低目的基因蛋白质表达水平降低，实现基因沉默的目的。本研究第二部分针对IBRVgB基因的shRNA重组Hl表达质粒，通过脂质体转染293T细胞，24h后转染pcDNA3．1．gB重组质粒，观察细胞病变情况，并壹岛盔些太堂亟±生僮i金塞趱要检测荧光情况和gB保守区基因的表达情况。试验结果表明，人工设计的两对shRNA在293T模式细胞可一定程度上沉默IBRV基因的表达，使其表达量明显受到抑制，为今后IBRV

7、RNAi生物制齐0的研究奠定基础。关键词：牛传染性鼻气管炎病毒；班蛋白：gB：RNAiExpressionofInfectiousBovineRhinotracheitisVirusGlycoproteinEandRNAInterferenceAgainstIBRVgBGeneAhstrnetInfectiousBovineRhinotracheitis(IBR)isafeverishandcon