shrna沉默p115基因表达抑制胃癌血管生成的体外研究

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文组织及细胞中pll5高表达r丌，以上研究说明高尔基体囊泡运输蛋白pl15在诸多方面和肿瘤发生发展密切相关。胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一，尽管随着社会和经济的发展，人们的医疗意识，经济水平的提高，明显降低了胃癌的发病率及死亡率，但就中国而言，胃癌仍然是导致病人死亡的恶性肿瘤之一【8l。正是因为胃癌的极大的危害性，研究探讨胃癌的发生发展的分子机制，胃癌相关的治疗及预防显得非常重要。文献报道抑制胃癌血管生成有助于抑制胃癌细胞生长，浸润和转移191。高尔基体作为胃癌中重要的细胞器，研

2、究发现高尔基体参与肿瘤血管的调控，因此高尔基体囊泡运输蛋白pll5是否与胃癌血管形成相关引起笔者注意。最新研究表明在炎症因子的刺激下，pll5能移位到细胞质中将细胞质的巨噬细胞移动抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)转运到细胞膜受体上发挥其相应的功能[71。MIF是一种独特的促进肿瘤发生的细胞因子，其能够通过磷脂酰肌醇3激酶(PhosphatidyIinosit01．3kinase，P13K)／蛋白激酶B．Akt(ProteinkinaseB．Akt)

3、途径促进肿瘤的血管生成【10，11，12，”1。通过前期实验研究发现pll5和MIF在不同分化胃癌细胞中都有表达，其中在低分化细胞株BGC．823中二者的含量最高【14I。续采用基因重组的技术，构建了4组pl15shRNA表达载体并将其转入胃癌BGC．823细胞中，筛选出pl15shRNA．1318能明显的抑制p115及MIF的表达并能抑制细胞增殖，证实pll5基因与胃癌细胞增殖密切相关，但是pll5在胃癌发生、发展中的作用究竟如何，还需进一步证实f”l。本实验选用沉默效果最好的pll5的shRNA．13

4、18转入胃癌BGC．823细胞，观察pll5的沉默后胃癌BGC．823细胞株中MIF，p-Akt，血管内皮生长因子A(Vascularendothelialfactor-A，VEGF．A)的表达情况，pll5能否抑制MIF的表达和分泌及MIF是否能通过P13K／Akt信号通路途径抑制胃癌微血管形成。8重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分shRNA抑制p115基因对胃癌BGC-823细胞1材料1．1质粒p115，MIF，p-Akt．VEGF-A表达的影响绿色荧光蛋白表达质粒(上海生工公司)1．2细胞株人胃

5、癌细胞株BGC．823，本实验室提供。1．3主要试剂DNAMarkerDL2000小量质粒提取试剂盒兔抗人pll5多克隆抗体兔抗人VEGF-A多克隆抗体兔抗人MIF多克隆抗体RPMll640培养基胰酶小牛血清胎牛血清阳离子脂质体Lipofectamine2000DEPCTRIZOL(总RNA提取试剂)RT-PCR试剂盒琼脂糖琼脂粉G4189TaKaRa公司Omega美国Abcam公司北京中杉金桥生物技术有限公司SantaCruz公司美国GIBCO公司杭州四季青生物制品有限公司lnvitrogen公司上海生

6、物技术公司Sigma公司分装TaKaRa公司西班牙进口分装(西班牙)Gibco公司重庆医科大学硕士研究生学位论文PCR引物合成SDS．PAGE凝胶配制试剂盒考马斯亮蓝R．250PVDF膜1．4主要试剂的配制重庆升博公司碧云天Amresco公司北京鼎国生物制品公司1)RPMI1640细胞培养基配制：取出一包RPMll640培养基干粉，NaHC031．69克加入895ml超纯水，加入磁力搅拌器搅拌至溶解，用C02调节pH值到7．15～7．38的范围之内，ddH20定容到1000ml，用前加入链霉素100U每毫

7、升，小牛或者胎牛血清配制成相应的15％的RPMI1640培养液。2)O．IMPBS配制：NaCI7．84克，Na2HP04．12H202．786克，KCl0．285克，KH2P040．192克，加入超纯水定至l000ml，放于4"C保存。3)胰酶配制：称取O．75克胰酶溶解于PBS(pH7．23---pH7．36)550毫升中，用滤膜滤除细菌和杂质后放于4"C保存。4)千分之一的DEPC水：0．75mlDEPC原液，纯净水750ml，放于摇床上过夜使其充分摇匀，高压蒸汽灭菌2个小时，室温冷却后4"C保存。

8、5)5xTBE缓冲液：Tris碱53．43克，硼酸26．8l克，0．5M(pH7．96)的EDTA18．5ml溶于820ml纯净水中，定容到1000ml，充分溶解，临用时再把它稀释成相应的倍数。6)1．5％琼脂糖凝胶：取3mg琼脂糖于三角烧瓶中，加入20mI的0．5xTBE，放在微波炉中加热到完全溶解，取出冷却到55℃左右，加入I微升GoldView室温冷却半个小时。7)5X电泳缓冲液：Tris(MWl21．14)7．51克，