汉森酵母表达载体的构建和人血管生成抑制素基因的表达

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1、!"卷#期微生物学报&’()!"0’)#"$$"年%$月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,’-./"$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!汉森酵母表达载体的构建和人血管生成抑制素基因的表达"许奕阳张添元罗进贤""（中山大学生物化学系基因工程教育部重点实验室广州#%$"4#）摘要：汉森酵母（!)"#$%&#’"()）是一类能以甲醇为唯一碳源和能源的甲基营养酵母，具有高表达外源基因、易于高密度发酵和产业化的特点。应用789技术扩增汉森酵母

2、甲醇氧化酶（:.,;<=’(’>?@

3、素能与抗人纤溶酶原抗血清特异结合，具有免疫原性。关键词：汉森酵母，表达载体，血管生成抑制素，基因表达中图分类号：P6%"文献标识码：H文章编号：$$$%2I"$1（"$$"）$#2$#6"2$#以毕节酵母（*+,(+)")-.#’+-）和汉森酵母（!)/-0/1$)"#$%&#’"()）为代表的甲基营养酵母是一类能以甲醇为唯一碳源和能源的酵母，由于其具有高效表达外源蛋白和易于实现［%Q"］高密度发酵和产业化等优点，已发展成为第二代酵母表达系统，特别是毕节酵母已作为常规系统得到广泛应用，汉森酵母比毕节酵母有较好的热耐受性（前者

4、5$RQ!5R，后者为5$R），且不需甲醇诱导就能高效表达外源基因，因而比*)")-.#’+-拥有更为快速和［5］简便的发酵生产方法，但对其表达系统的研究相对较少。血管生成抑制素（H=S?’A,<,?=）是近年来发现的血管生成抑制因子，它通过抑制血管内皮细胞的增殖及新生血管的形成［!］从而抑制继发瘤的生长和转移。最近发现它能抑制小鼠C.T?A肺癌、纤维肉瘤及人乳腺［#］癌、前列腺癌和结肠癌的生长。本文报道汉森酵母甲醇氧化酶（:*B）启动子和转录终止序列的克隆、表达载体的构建及人血管生成抑制素基因在汉森酵母中的表达和分泌。!材

5、料和方法!"!菌株与质粒大肠杆菌2),#$+UK%为本室保存，汉森酵母（!)/-0/1$)"#$%&#’"()）H%I（(.D2）及含有:*B基因的噬菌体!!4V%克隆由荷兰W=?(.X./9.A.

6、期："$$"2$%2"%，修回日期："$$"2$!2"6H期许奕阳等：汉森酵母表达载体的构建和人血管生成抑制素基因的表达HN:!"#主要试剂限制性内切酶，!"#$%连接酶等工具酶购自&’()*)+(,-公司，.*,扩增试剂盒购自(/01234516730528公司，#$%序列分析试剂盒为.1/8547公司的产品，纤溶酶原抗血清、:;’.!&、#%(等为92487公司的产品，!+.+<%!.为北京亚辉生物工程公司生产，辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白%（=,.+.1/>523%）为上海生物制品研究所研制，.*,引物由上海生工生

7、物工程公司合成。!"$培养基细菌培养用-(培养基，酵母培养和筛选用的?$(、9*、?.#及?.@&培养基的配方见文献［A］。!"%质粒的提取，酶解，回收，#$%连接，转化大肠杆菌等基因操作按文献［B］的方法进行。!"&.*,扩增以!C"#$%&#’"()6)DE#$%为模板，扩增条件为第一循环变性F"G:823，退火HHGI823，延伸B;GI823；以后每个循环F"GI823，退火HHGI823，延伸B;GI823，共:J个循环。!"’.*,产物的克隆和序列分析.*,产物经纯化和酶切鉴定后，克隆至质粒K9.B;进行测序，方

8、法参照.1/8547公司!74!17EL测序试剂盒提供的程序进行。!"(酵母转化［N］参照(/4<73/M7的方法。!")人血管生成抑制素基因在!""#$%&#’"()%!’中的诱导表达将转化子接种于?.&@培养基中，:BG振荡培养至对数生长后期，添加甲醇至终浓度IO进行诱导，以后每隔;"