hbv pres1基因酵母表达载体的构建及表达

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1、HBVpreS1基因酵母表达载体的构建及表达：张曦，蔺淑梅，吴列秀，陈天艳，叶峰，赵英仁，张树林【摘要】　　目的构建HBVpreS1基因的酵母表达载体，探讨HBVpreS1蛋白的功能。方法以HBVayerasechainreaction,PCR)扩增HBVpreS1基因，克隆到pGEMT载体中命名为TpreS1，以NcoⅠ和MluⅠ双酶切TpreS1后回收与酵母表达载体pSos连接，对重组质粒进行序列测定后命名为pSospreS1，经醋酸锂法将其转化酵母菌cdc25(a)，提取酵母蛋白质进行ethodsPCRedtoamplifyHBVpreS1genefromtheplasm

2、idPCP10/HBVayentofHBV,andthePCRproductedTpreS1.HBVpreS1geneTpreS1byNcoⅠandMluⅠ,andclonedintoyeastexpressionplasmidpSos;thereconstructedplasmidedpSospreS1.pSospreS1edintoyeastcellcdc25(a)byLiAcmediatedtransformation,andtheyeastproteinedbyyr，阳性对照质粒pSosMAFB、pMyrMAFB、pMyrSB，阴性对照质粒pSosColⅠ、pMyrLa

3、minC，预制肝文库均为Stratagene公司产品；HBVaymol/L)1μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，P1(10μmoL/L)1μL，P2(10μmoL/L)1μL，TaqDNA聚合酶(5u/μL)0.6μL，加灭菌水至终体积50μL。反应条件：94℃3min，94℃1min，53℃1min，72℃1min，共30个循环，72℃5min。取5μL反应产物进行20g/L琼脂糖凝胶电泳分析。　　1.2.3PCR产物的克隆鉴定　　PCR产物经北京鼎国胶回收试剂盒回收纯化后，与T载体按克分子3∶1的比例，在T4连接酶的催化下，16℃过夜进行体外连接重组，将连接产物全部转化大

4、肠杆菌DH5α感受态细胞，在铺有IPTG和XGal的氨苄青霉素LB平板上进行蓝白菌落筛选。随机挑取白色菌落，以碱裂解法小量提取质粒并行PCR及双酶切鉴定后，由上海生工生物工程公司进行测序，测序正确者命名为TpreS1。　　1.2.4诱饵质粒的构建和鉴定　　用NcoⅠ和MluⅠ双酶切TpreS1和pSos，回收preS1及pSos载体片段，用T4连接酶进行体外连接重组，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选出阳性克隆后，以碱裂解法小量提取质粒，行限制性内切酶分析，鉴定正确者送上海生工生物工程公司利用酵母表达载体pSos的引物(P1：CCAAGACCAGGTACCATG；P2

5、：GCCAGGGTTTTCCCAGT)测序，测序正确者命名为pSospreS1。　　1.2.5制备酵母感受态细胞　　所用酵母菌株为cdc25(a)，采用醋酸锂转化法，按照试剂盒(Stratagene公司)说明书操作。将冻存的cdc25(a)划线接种于新鲜的YPAD平板，倒置于室温(22～25℃)孵育4～6d，挑取4～5个单克隆于1mLYPAD液体培养基中，剧烈振荡后接种于含50mLYPAD的250mL三角烧瓶中，室温(22～25℃)、220～250r/min振摇14～16h至A600>1.0。在2L的三角烧瓶中用YPAD稀释过夜菌液后(终体积300mL，A600=0.2～0.3

6、)，置摇床室温(22～25℃)、220～250r/min振摇3h至A600>0.7。取75μL菌液铺于YPAD平板，封口膜封闭后置37℃孵育4～6d。将剩余的菌液室温(22～25℃)、1000r/min离心5min，弃上清；以50mLddH2O重悬细胞，再置室温(22～25℃)、1000r/min离心10min，弃上清；用50mLLiSORB重悬细胞，室温(22～25℃)孵育30min，室温(22～25℃)1000r/min离心5min，弃上清；再用300μLLiSORB重悬酵母细胞，加入600μL预先准备好的鲑精DNA与LiSORB的混合物，小心轻柔完全混匀，加入5.4mLPE

7、G/LiOAc和530μLDMSO，小心彻底混匀，在1.5mL的Ep管中分装500μL，其余的每管100μL分装。　　1.2.6转化酵母感受态细胞　　将质粒pSospreS1和pSos分别加入100μL制备好的cdc25(a)酵母感受态细胞。每管加入2μL新鲜制备的1.4mol/Lβ巯基乙醇，小心混匀后置室温(22～25℃)孵育30min，42℃热休克20min，迅速置冰上3min，14000r/min室温(22～25℃)离心30s，弃上清