shrna表达载体共沉默bcl-2、survivin基因抑制宫颈癌hela细胞生长的实验研究

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：乏仁墼塑!日期：商业：、如苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆

2、、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在——年一月解密后适用本规定。非涉密论文口译文作者签名：二咝一日期：垦翌珥导师签名：￥滥日期：竺掣shRNA表达载体共沉默Bcl-2、Survivin基因抑制宫颈癌Hela细胞生长的实验研究中文摘要shRNA表达载体共沉默Bcl-2、Survivin基因抑制宫颈癌Hela

3、细胞生长的实验研究中文摘要目的：RNA干扰近年来已被广泛应用于肿瘤基因功能和基因治疗的研究领域，然而几乎所有肿瘤细胞不是单一基因控制的，而且许多恶性肿瘤细胞具有显著的遗传异质性和表型变异性，提示传统靶向单个基因沉默技术并不能从根本上根除肿瘤。shRNA共表达可以同时抑制多个基因或同一基因多个靶点的表达，目前已被众多研究者关注【l】。本课题选择与肿瘤凋亡密切相关的Bcl-2和Survivin两个基因，通过构建shRNA串联表达载体转染人宫颈癌Hela细胞，体内、外观察同时沉默Bcl-2和Survivin基因的表达对人宫颈癌Hela细胞生长的影响，并通过与单独沉默

4、单个基因比较探讨双基因共沉默的优势，为宫颈癌的多基因治疗奠定实验基础。方法：①根据Bcl-2、Survivin的cDNA序列分别设计构建Bcl-2shRNA重组质粒pGenesill．2-Bcl-2，SurvivinshRNA重组质粒pGenesill．1-Survivin及阴性对照重组质粒pGenesill．1--HK。②由Bcl-2、Survivin重组质粒构建双基因串联shRNA质粒表达载体pGenesill．1+2-(Bcl-2+Survivin)。③实验分为五组：Bcl组，转染重组质粒pGenesill．2-Bcl-2；Sur组，转染重组质粒pGen

5、esill．1-Survivin；Bcl+Sur组，转染重组质粒pGenesill．1+2-(Bcl-2+Survivin)；Neg组，转染阴性对照质粒pGenesill．1--HK；Blank组，未转染空白对照组，分别进行体内外实验。④瞬时转染24h、48h、72h时，RT-PCR测定各组Bcl-2和SurvivinmRNA表达；Hoechst33258染色和FCM检测瞬时转染48h细胞周期和凋亡情况；(亘)G418筛选获得稳定转染Hela细胞，RT-PCR测定稳定转染Bcl-2、SurvivinmRNA表达，FCM和Western-blotting检测稳定

6、转染细胞Bcl-2和Survivin蛋白表达；MTT检测各稳定转染组细胞增殖能力及对顺铂刺激的敏感性：⑥稳定转染Hela细胞接种BALB／c裸鼠，观测各组成瘤时间、瘤体积和瘤重量的变化，免疫组化测定Bcl-2和Survivin蛋白表达。结果：①酶切和测序结果表明成功构建shRNA重组质粒表达载体中文摘要shRNA表达载体共沉默Bcl-2、Survivin基因抑制宫颈癌Hela细胞生长的实验研究pGenesill．2-Bcl-2、pGenesill．1-Survivin、pGenesill．1-HK；②酶切鉴定结果显示双基因shRNA串联质粒表达载体pGenes

7、ill．1+2-(Bcl-2+Survivin)构建成功；③各重组质粒表达载体转染Hela细胞，瞬时转染24h、48h、72hRT--PCR结果显示，三个时间点单独沉默或共沉默组均能有效抑制相应基因mRNA表达，以48h抑制效果最显著，联合沉默Bcl+Sur组在瞬时转染48h对Bcl-2mRNA和SurvivinmRNA表达抑制率分别为85．71％和60．56％，均显著高于转染单基因shRNA的Bcl组和Sur组(P

8、士0．34)％(P<0，05)和Sur