rnai沉默igf-1r表达对宫颈癌hela细胞生长和药物敏感性的实验研究

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1、硕士学位论文论文题目RNAi沉默IGF-1R表达对宫颈癌Hela细胞生长和药物敏感性的实验研究研究生姓名武炜指导教师姓名申咏梅专业名称临床检验诊断学研究方向肿瘤基因治疗论文提交日期2013年3月RNAi沉默IGF-1R表达对宫颈癌Hela细胞生长和药物敏感性的实验研究中文摘要RNAi沉默IGF-1R表达对宫颈癌Hela细胞生长和药物敏感性的实验研究中文摘要目的：宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，其发病率已超过结直肠癌，仅次于乳腺癌，跃居女性恶性肿瘤的第二位。目前治疗宫颈癌传统的方法是手术、

2、放疗和化疗，但作用效果有限且副作用明显，而近几年来兴起的RNA干扰（RNAi）技术给宫颈癌的治疗带来了新的希望。本课题选择与胰岛素样生长因子（IGFs）信号传导通路有关的胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）作为研究对象，利用RNAi技术，通过构建IGF-1RshRNA重组质粒表达载体转染人宫颈癌Hela细胞，体内、外观察沉默IGF-1R基因对Hela细胞生长的影响，并联合化疗药物顺铂刺激，以检测其敏感性变化，为进一步研究宫颈癌的基因治疗奠定实验基础。方法：①根据GenBank中IGF-1R基因

3、的cDNA序列，通过软件分析IGF-1RmRNA结构筛选出四个拟干扰靶位点，并设计四条干扰序列和一条与人类任何基因均无同源性的阴性对照序列，并将其构建成IGF-1RshRNA重组质粒表达载体，经测序和酶切鉴定后，提取各重组质粒转染Hela细胞；②实验分为六组，即pGPU6-IGF-1R-1组、pGPU6-IGF-1R-2组、pGPU6-IGF-1R-3组、pGPU6-IGF-1R-4组、pGPU6-NC组和空白对照Blank组，分别进行体内外实验；③瞬时转染24h、48h、72h时，荧光显微镜和

4、流式细胞仪分别检测各组细胞的转染效率；RT-PCR检测各组细胞IGF-1R和MMP-9mRNA的表达；流式细胞仪检测IGF-1R蛋白表达；Hoechst33258检测各组转染细胞的凋亡情况；CCK8检测各组转染细胞的增殖能力及对顺铂（DDP）刺激的敏感性，根据以上实验结果从四条干扰序列中选择一条干扰效果较好的序列用于后续稳定转染实验；④G418筛选上述干扰效果较好序列和阴性对照序列并获得稳定转染Hela细胞，荧光显微镜和流式细胞仪检测各组稳定转染细胞的转染效率；RT-PCR检测各组细胞IGF-1

5、R和MMP-9mRNA的表达；Western-blotting检测各组IGF-1R、MMP-9的蛋白表达情况；划痕实验检测各组细胞侵袭力改变；CCK8检测各组稳定转染细胞的增殖能力和对顺铂（DDP）刺激敏感性的变化；⑤各组稳定I中文摘要RNAi沉默IGF-1R表达对宫颈癌Hela细胞生长和药物敏感性的实验研究转染Hela细胞接种BALB/c裸鼠，12天后分别腹腔注射0.9%氯化钠注射液（NS）和顺铂（DDP），观察各组裸鼠成瘤时间、瘤体积和瘤重量的变化，免疫组化技术测定IGF-1R蛋白表达。结果

6、：①酶切和测序结果表明成功构建IGF-1RshRNA重组质粒表达载体pGPU6-IGF-1R-1、pGPU6-IGF-1R-2、pGPU6-IGF-1R-3、pGPU6-IGF-1R-4和pGPU6-NC；②各重组质粒表达载体转染Hela细胞，瞬时转染24h、48h、72h时的转染效率均达80%以上，满足实验要求。RT-PCR结果显示，三个时间点四个实验组均能有效抑制IGF-1R和MMP-9mRNA表达，以48hpGPU6-IGF-1R-1组抑制效果最为显著（P<0.01），其对IGF-1R、M

7、MP-9mRNA表达抑制率分别为67.42%、39.21%；CCK8实验结果显示瞬时转染12h、24h、36h、48h、72h各实验组细胞的增殖能力均受到抑制，其中pGPU6-IGF-1R-1组抑制率最显著（与其他三个实验组和对照组比较，P<0.05）。CCK8检测各组细胞三个时间点对DDP刺激24h、48h、72h后的敏感性变化显示，pGPU6-IGF-1R-1组在瞬转48h时对DDP刺激48h后的敏感性变化最明显；③瞬时转染48h时，FCM结果显示pGPU6-IGF-1R-1组对IGF-1R

8、蛋白表达抑制率为54.62%，显著高于其他各实验组（P<0.05）；Hoechst33258染色结果显示，pGPU6-IGF-1R-1组的凋亡率(21.89±0.36)%显著高于pGPU6-IGF-1R-2组(10.89±0.79)%、pGPU6-IGF-1R-3组(13.71±0.69)%、pGPU6-IGF-1R-4组(12.12±0.77)%；④G418成功筛选瞬时转染时对IGF-1R基因干扰效果较好的pGPU6-IGF-1R-1组重组质粒的稳定转染Hela细胞，转染效率达65%以上，RT