rnai沉默survivin基因抑制人胰腺癌patu+8988细胞生长实验的研究

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1、苏州大学硕士学位论文RNAi沉默Survivin基因抑制人胰腺癌Patu8988细胞生长的实验研究姓名：宋妙丽申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：申咏梅20090401RNAi沉默Survivin基因抑制人胰腺癌Patu8988细胞生长的实验研究中文摘要8988细胞生长的实验研究中文摘要目的：Survivin是近年新发现的凋亡抑制蛋白(inhibitionapoptosisprotein，IAP)家族成员之一，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，在胰腺癌组织中高表达而在正常组织中不表达，其表达与胰腺癌的细胞增殖、凋亡和血管生成密

2、切相关。通过调低该基因的表达有助于抑制细胞增殖，逆转肿瘤形成。RNA干扰(IⅢAi)能高效特异地调低基因表达，已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过构建SurvivinshRNA重组质粒转染胰腺癌Patu8988细胞，体内、外观察shRNA表达载体对Patu8988细胞Survivin基因表达的影响，以及对Patu8988细胞生长的抑制作用，探讨Survivin基因在胰腺癌中的作用，为进一步研究胰腺癌的基因治疗奠定实验基础。方法：①软件分析SurvivinmRNA结构以筛选出拟干扰靶位点，构建SurvivinshRNA重组质粒pGene

3、sil．1．Survivin．1、pGenesil．1一Survivin．2和pGenesil．1．Survivin．1+2，同时构建阴性对照重组质粒pGenesil．1-NC，经酶切和测序鉴定后，提取各组重组质粒转染Patu8988细胞；②实验分为空白对照组、pGenesil．1．Survivin．1组、pGenesil．1．Survivin．2组、pGenesil．1．Survivin．1+2组和pGenesil一1-NC组，分别进行体内、外实验；③在48h时检测细胞凋亡，RT-PCR和FCM测定SurvivinmRNA和Survi

4、vin蛋白的相对含量，以观察各重组质粒瞬时转染Patu8988细胞后对Survivin基因表达的抑制作用；④MTT测定细胞增殖能力，Western．blotting测定Survivin蛋白的表达：@}G418筛选获得各重组质粒的稳定转染Patu8988细胞，接种BALB／e裸鼠，建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量，免疫组化测定Survivin蛋白表达，透射电镜观察瘤细胞超微结构，研究SurvivinshRNA对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。结果：①酶切和测序鉴定证实重组质粒pGenesil．1．Survivin一1、

5、pGenesil．1．Survivin．2、pGenesil．1．Survivin．1+2和pGenesil．1-NC构建成功；②FCS4测得各组转RNAi沉默Survivin基因抑制人胰腺癌Patu8988细胞生长的实验研究中文摘要染细胞百分比均大于60％；瞬时转染48h，pGenesil．1．Survivin．1、pGenesil．1．Survivin一2和pGenesil．1．Survivin．1+2对Patu8988细胞SurvivinmRNA抑制率分别是空白对照组的65．62％、54．89％、64．96％，与空白对照组相比差异

6、具有显著性意义(p

7、Genesil．1．Survivin．1+2组移植瘤的平均成瘤时间略有延迟，与空白对照组相比差异无显著性∽0．05)，pGenesil-l-Survivin-1组、pGenesil一1一Survivin-2组和pGenesil．1．Survivin．1+2组平均瘤体积、瘤重量明显下降；切片的免疫组化结果显示：瘤体组织大片状坏死，影响蛋白的正常表达；透射电镜显示各组瘤细胞凋亡很少，与PI检测细胞凋亡结果一致；⑤实验结果表明：pGenesil一1．Survivin．1组对Patu8988细胞Survivin的干扰作用最好，抑制瘤细胞的增殖也

8、最明显，略优于pGenesil．1．Survivin．1+2组，pGenesil．1．Survivin．2组干扰作用最差，而pGenesil．1-NC对Patu8988细胞Survivin基因无明显干扰作用