特异sirna沉默slug基因抑制体外胰腺癌aspcl细胞生长的实验研究

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1、特异siRNA沉默Slug基因抑制体外胰腺癌AsPCl细胞生长的实验研究【关键词】Slug：小干扰RNA;瞬时转染;增殖：凋亡;胰腺肿瘤;AsPC1　　[ABSTRACT]Objective:ToinhibitSlugexpressioninpancreaticcancercellsallinterferingRNA(siRNA),andexploreitseffectoncellproliferationandapoptosis.Methods：PlasmaidSpSIugsiRNAandpN

2、egSiRNA(negativecontrol)inedbyMTTassay.Theapoptoticratesofthecellsetry.Results：TpSlugsiRNAandpNegsiRNAtransfectedAsPC1cells.SlugexpressioninAsPC1cellsarkedlyaftertransfectionofpSlugsiRNA.TheapoptosisrateoreeasilybyHoechst33258andPIstainingat72hin

3、pSlugsiRNAcellsthaninpNegsiRNAandcontrolcells.Conclusion：SluginhibitioncaninhibittheproliferationofAsPC1cellinvitro,andacceleratetheapoptosis.　　[KEYA的强烈抑制基因[3]，而PUMA是促凋亡基因，因此，干扰Slug可能解除Slug对PUMA的抑制，促进细胞凋亡并抑制细胞生长。本文旨在研究S1ug基因沉默后对胰腺癌AsPC1细胞的增殖和凋亡的影响，探

4、讨胰腺癌基因治疗的新靶点。　　1材料与方法　　1.1材料和试剂　　人胰腺癌细胞株AsPC1购自中科院上海细胞所、pGenesill质粒购自Austin，USA、感受态大肠杆菌DH5α购自武汉晶赛生物工程技术公司、限制性核酸内切酶BamHI、HindⅢ、T4连接酶为Promega公司产品、LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品、四甲基偶氮唑蓝(MTT)为sigma公司产品、BCA蛋白浓度测定试剂盒及敏感曝光试剂盒为Pierce公司产品;Slug多克隆抗体及G3PDH抗体

5、为SantaCruz公司产品、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗为北京中山公司产品，凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司，siRMA的转录模板由上海生工合成，合成的DNA合成片段序列为：　　Sluglsense　　5tgcaaatgtacccaatgatattcaagagatatcattgggtacatttgcttttttC3　　Sluglantisense　　5tcgagaaaaaagcaaatgtacccaatgatatctcttgaatatcattgggtacatttgca

6、3　　1.2方法　　1.2.1质粒的构建合成的siRNA转录模板序列中间为加入9个茎环序列分隔的正反向靶序列，尾端插入5个TTTTT作为终止序列，上游和下游分别加了BamHI、HindIII酶切位点，pGenesil1质粒经BamHI、HindlII酶切后与合成的表达模板DNA片段用T4DNA连接酶连接(160℃8h)，转化DH5α菌株，涂卡那霉素琼脂平板，挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，用BamHI、HindⅢ双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆送Invitrogen公司测序，测序引物为5'caagg

7、tcgggcaggaagag3'，测序正确后大量提取质粒。　　1.2.2细胞培养细胞用含10%胎牛血清的RPMRl640培养基培养，细胞培养条件为37℃恒温，饱和湿度和5%CO2，每2～3天传代一次，指数生长的细胞为实验对象。　　1.2.3细胞瞬时转染在6孔培养板中常规接种AsPC1细胞，待细胞70%～80%融合后，经LipofectamineTM2000介导质粒转染AsPC1细胞72h(按试剂盒说明操作)。　　1.2.4AnnexinVFITC/PI染色收集3组细胞，每组设3个复孔。用去离子

8、水按1∶4稀释结合缓冲液。用4℃预冷的1×PBS洗细胞2次，用250g结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为l×106/mL。取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加入5μLAnnexinV/FITC和10μL20μg/mL的PI溶液。混匀后于室温避光孵育15min。在反应管中加入400μLPBS，混匀，流式细胞仪(FACS)分析，激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。　　1.2.5MT