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时间:2018-11-02
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1、特异siRNA沉默Slug基因抑制体外胰腺癌As【摘要】目的:研究Slug基因沉默对胰腺癌AsPCl细胞增殖、凋亡的影响。方法:构建靶向抑制S1ug的siRNA表达载体,瞬时转染AsPC1细胞。采用RTPCR和TT检测细胞增殖,AnnexinVFITC/PI了解细胞凋亡的变化。结果:成功构建了pGenesillSlugsiRNA(pSlugsiRNA)和pCenesil1NegsiRNA(pNegsiRNA)表达质粒。pSlugsiRNA瞬时转染AsPC1细胞72h后,细胞S1ug表达及生长受到明显抑制,细胞凋亡
2、率明显增加。结论:SlugsiRNA抑制Slug表达,促进AsPC1细胞凋亡并抑制细胞的增殖。【关键词】Slug:小干扰RNA;瞬时转染;增殖:凋亡;胰腺肿瘤;AsPC1 [ABSTRACT]Objective:ToinhibitSlugexpressioninpancreaticcancercellsallinterferingRNA(siRNA),andexploreitseffectoncellproliferationandapoptosis.Methods:PlasmaidSpSIugsiRNAandpNegSiRNA
3、(negativecontrol)inedbyMTTassay.Theapoptoticratesofthecellsetry.Results:TpSlugsiRNAandpNegsiRNAtransfectedAsPC1cells.SlugexpressioninAsPC1cellsarkedlyaftertransfectionofpSlugsiRNA.TheapoptosisrateoreeasilybyHoechst33258andPIstainingat72hinpSlugsiRNAcellsthaninpNegs
4、iRNAandcontrolcells.Conclusion:SluginhibitioncaninhibittheproliferationofAsPC1cellinvitro,andacceleratetheapoptosis. [KEYA的强烈抑制基因[3],而PUMA是促凋亡基因,因此,干扰Slug可能解除Slug对PUMA的抑制,促进细胞凋亡并抑制细胞生长。本文旨在研究S1ug基因沉默后对胰腺癌AsPC1细胞的增殖和凋亡的影响,探讨胰腺癌基因治疗的新靶点。 1材料与方法 1.1材料和试剂 人胰腺癌细胞株AsPC1购自
5、中科院上海细胞所、pGenesill质粒购自Austin,USA、感受态大肠杆菌DH5α购自武汉晶赛生物工程技术公司、限制性核酸内切酶BamHI、HindⅢ、T4连接酶为Promega公司产品、LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品、四甲基偶氮唑蓝(MTT)为sigma公司产品、BCA蛋白浓度测定试剂盒及敏感曝光试剂盒为Pierce公司产品;Slug多克隆抗体及G3PDH抗体为SantaCruz公司产品、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗为北京中山公司产品,凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司,s
6、iRMA的转录模板由上海生工合成,合成的DNA合成片段序列为: Sluglsense 5tgcaaatgtacccaatgatattcaagagatatcattgggtacatttgcttttttC3 Sluglantisense 5tcgagaaaaaagcaaatgtacccaatgatatctcttgaatatcattgggtacatttgca3 1.2方法 1.2.1质粒的构建合成的siRNA转录模板序列中间为加入9个茎环序列分隔的正反向靶序列,尾端插入5个TTTTT作为终止序列,上游和下游分别加了BamHI
7、、HindIII酶切位点,pGenesil1质粒经BamHI、HindlII酶切后与合成的表达模板DNA片段用T4DNA连接酶连接(160℃8h),转化DH5α菌株,涂卡那霉素琼脂平板,挑选阳性克隆,扩增并提取质粒,用BamHI、HindⅢ双酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆送Invitrogen公司测序,测序引物为5'caaggtcgggcaggaagag3',测序正确后大量提取质粒。 1.2.2细胞培养细胞用含10%胎牛血清的RPMRl640培养基培养,细胞培养条件为37℃恒温,饱和湿度和5%CO2,每2~3天传代一次,指数生长的细胞
8、为实验对象。 1.2.3细胞瞬时转染在6孔培养板中常规接种AsPC1细胞,待细胞70%~80%融合后,经LipofectamineTM2000介导质粒转染AsPC1细胞72
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