白藜芦醇对宫颈癌hela细胞vegf表达和增殖的

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1、白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞VEGF表达和增殖的　　【摘要】目的探讨白藜芦醇在体外对宫颈癌Hela细胞VEGF表达的影响。方法MTT法检测不同浓度(0、12.5、25、50、100、200、300、400、600μmol/L)Res处理24、48、72h对HeLa细胞的抑制率;RT-PCR方法检测VEGFmRNA表达水平,ethodsProliferationinhibitoryeffectRNAeasuredsemi-quantitativelybyRT-PCR,andtheproteinlevele-d

2、ependeffects;ThelevelofVEGFancervicalcancerHelacelllineinvitro.　　【Keya公司。浓度为99%白藜芦醇粉末用二甲基亚砜(DMSO)溶解,配成200μmol/L的储备液,正压过滤除菌分装,4℃保存备用,实验前以培养液稀释成所需的不同浓度。四甲基偶氮唑蓝(MTT):武汉博士德公司产品,用天平称取MTT0.25g溶于50mLPBS浓度为5mg/mL在搅拌机上搅拌30分钟,过滤除菌,分装,4℃保存。DMSO购自美国Neentas公司,引物由上海生工生

3、物工程技术服务有限公司合成。VEGF小鼠单克隆抗体为Santacruz公司产品,SP试剂盒及DAB试剂均购自北京中杉试剂有限公司。　　1.2细胞培养人宫颈癌Hela细胞株购自中科院上海细胞所,采用培养于含的RPMI1640培养液培养(内含10%小牛血清,青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL)。培养条件为5%CO2,37℃。　　1.3MTT法检测白藜芦醇对细胞增殖的作用将细胞以密度1×104/孔接种于96孔培养板中培养,培养12小时后,加入不同浓度的白藜芦醇(0、12.5、25、50、100、200、

4、300、400、600μmol/L)继续培养。细胞培养24、48、72h后加入MTT(5mg/mL)继续培养4h,加入100μLDMSO,震荡10min。酶标仪上波长490nm测定OD值。细胞生长抑制率(IR):IR(%)=(1-试验孔A均值/对照孔均值)×100%。IC50值由NDST软件计算。每组设三个复孔,重复三次。　　1.4半定量RT-PCR检测VEGFmRNA的表达分别设计与合成VEGF引物:上游:5′-AACCAGCAGAAAGAGGAAAGAGG-3′,下游:5′-CCAAAAGCAGGTCA

5、CTCACTTTG-3′(产物长度133bp);β-actin引物:上游5′-GGGCGCCCCAGGCACCA-3′,下游5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′(产物长度537bp)。用TRIzol试剂提取细胞总RNA,按逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA,然后进行CDl47和β-actin同管扩增。PCR体系为25μL,反应条件:94℃预变4min,94℃变性50s,55℃退火1min,72℃延长50s,共36个循环,最后72℃延伸10min。扩增含0.5mmol/L溴化乙锭的15g

6、/L琼脂糖凝泳30min,电泳后用凝胶分析扫描系统中测定各产物的吸光度(A)值,所有扩增A峰值均以β-actin为基准进行校正。　　1.5免疫印迹法检测细胞VEGF蛋白的表达按TT方法检测白藜芦醇在不同作用时间和作用浓度下对Hela细胞的增殖抑制作用,结果如图1所示。　　结果显示,白藜芦醇浓度低于50μmol/L时,对细胞增殖无影响;白藜芦醇浓度大于50μmol/L时,逐渐表现出对细胞增殖的抑制作用,抑制作用随浓度增高和作用时间的延长而增强,呈时间-剂量依赖性(P<0.01)。在600μmol/L时,

7、其增殖抑制率在24、48、72h分别为42.6%、59.3%和92.1%。通过计算其IC50值等于284.6μmol/L,因此采用200μmol/L和300μmol/L的浓度进行后续实验。　　2.2RT-PCR方法检测Hela细胞VEGFmRNA水平表达的变化如图2A所示,未加药物处理的对照组Hela细胞高表达VEGFmRNA,经过200μmol/L和300μmol/L白藜芦醇分别处理24,48和72h后,VEGFmRNA的表达水平明显下降,其下降程度分别为21.4%、39.3%、61.2%和50.3%、7

8、2.9%、82.7%,与未经处理的细胞比,均具有统计学意义(P<0.001)。这种抑制作用随浓度的增加和作用时间的延长而增强,提示白藜芦醇在转录水平呈剂量和时间依赖性下调Hela细胞VEGFmRNA表达。　　2.3amani-MatsuduM,etal.Resveratrolinhibitsthegroalandleukemichematopoieticcells[J].Carcinogenesis,200