泛素特异性蛋白酶usp46的错义突变a81v和t187p与adhd的关联性研究

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1、河北医科大学硕士学位论文泛素特异性蛋白酶USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究姓名：王超楠申请学位级别：硕士专业：流行病与卫生统计学指导教师：田庆宝201203中文摘要泛素特异性蛋白酶USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究摘要目的：泛素．蛋白酶体通路(ubiquitin．proteasomepathway)通过泛素与靶蛋白赖氨酸残基的结合来参与调控生物体内多种重要进程，包括细胞膜转运，组蛋白修饰，转录调控，DNA的修复及复制等。溶酶体系统和泛素蛋白酶体通路共同构成细

2、胞内蛋白质降解的主要途径。与蛋白质磷酸化和去磷酸化一样，泛素化和去泛素化是一个被严格调控的可逆过程，其中去泛素化酶(DUB)是调控中的一个重要环节。泛素特异性蛋白酶(USPs)是去泛素化酶成员中最多的一类，它通过去除靶蛋白上的泛素分子来对蛋白质的泛素化进行负向调节。研究发现多种去泛素化酶与神经系统病变等众多疾病的发生有密切的关系。USP46是本课题组克隆成功的泛素特异性蛋白酶，位于4q12，编码366个氨基酸。最近研究发现，泛素特异性蛋白酶USP46在悬尾试验(TailSuspensionTest，TST)和强迫

3、游泳试验(ForcedSwimmingTest，FST)中是调节小鼠不动行为的数量性状基因。usp46第92号赖氨酸的缺失后小鼠的不动时间明显缩短，因此他们提出去泛素化酶USP46与小鼠的行为抑郁有关。而我们课题组在克隆出“印96的同时也证明了usp46的第92号赖氨酸缺失后，其去泛素酶活性降低为野生型的27．04％。本课题通过构建USP46错义突变A81V、T187P的表达质粒和去泛素化酶活性检测体系，分析A81V、T187P对酶活性的影响。同时，通过建立USP46错义突变的基因分型方法，在中国汉族人群和儿童注

4、意缺陷多动障碍(AttentionDeficit／Hyperactix，ityDisorder，ADHD)患者中对USP46A81V、T187P突变进行初步筛查，为进一步的分子流行性学研究奠定基础。方法：(1)以课题组前期克隆成功的质粒pACT7．usp46．WT、pGEX．usp46一WT为模板，采用定点突变法构建usp46突变型质粒pACT7．usp46．T187P，pGEX-usp46-T187P，pGEX—usp46一A81V，pGEX．usp46．C44S，中文摘要并测序验证，为突变型USP46的活性分

5、析做准备(usp46突变型C44S为44号半胱氨酸定向突变为丝氨酸；A81V为81号丙氨酸定向突变为缬氨酸；T187P为187号苏氨酸定向突变为脯氨酸)。(2)采用T7．USP／GST-Ub52去泛素化酶活性检测体系，以GST-Ub52为模型底物检测USP46C44S、A81V、T187P突变型的去泛素化酶活性。USP46fl勺表达质粒分别与pGEX．Ub52共表达。去泛素化酶UBP2为阳性对照。经GSH．Sepharose．TMResin纯化蛋白系统纯化GST融合蛋白，进行10％SDS．PAGE电泳检测。以野生

6、型USP46的活性为标准(即切断产物fl勺36kDa蛋白条带亮度与45kDa底物蛋白条带亮度的比值)，采用Od、，ssey双色红外激光成像系统分析野生型和突变型的活性差异。用兔抗T7多克隆抗体检测融合蛋白T7．USP的表达情况。(3)采用GST．USP／Ub．Met—B．gal去泛素化酶活性检测体系，以Ub．Met．p—gal为模型底物检测USP46C44S、A81V、T187P突变型的去泛素化酶活性。可表达GST的USP表达质粒与pAC．ub—p．gal模型底物质粒共转化BL21感受态细胞，研究去泛素化酶野生型

7、及突变型将模型底物Ub．Met．B．gal融合蛋白去泛素化的能力，从而分析USP46野生型与突变型的去泛素化活性。去泛素化酶L33P2作为阳性对照。用小鼠抗B—gal单克隆抗体检测底物Ub—Met．p．gal的表达情况，用兔抗GST多克隆抗体检测融合蛋白GST_USP的表达情况。以野生型USP46的活性为标准(即切断产物Met—p．gal蛋白条带亮度与Ub．Met．p．gal底物蛋白条带亮度的比值)，采用Od)，ssey双色红外激光成像系统分析野生型及突变型活性差异。(4)收集健康人群及ADHD患病儿童的血液样本

8、。(5)建立去泛素化酶usp46{昔义突变基因检测方法。提取血液样本中的基因组DNA。分别设计扩增A81V、T187P位点的特异性引物，确定扩增特异性DNA片段的PCR反应参数。(6)将特异扩增t)匀usp46A81V、T187P目的片段进行测序分型。(7)利用DNAStar矛HChromas软件对结果进行分析。结果：(1)构建出usp46突变质粒pACT7．usp46．