泛素特异性蛋白酶25调节ⅰ型干扰素信号通路的分子机制

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1、分类号华中农业大学硕士学位论文密级泛素特异性蛋白酶25调节I型干扰素信号通路的分子机制ThemolecularmechanismsofUSP25regulationIinterferonsignalingpathway研究生：钟会娟学号：2010302110173指导教师：方六荣教授指导小组：方六荣教授肖少波教授江云波副教授罗锐副教授专业：预防兽医学获得学位名称：农学硕士研究方向：动物病毒学获得学位时间：2013年6月华中农业大学动物科学．动物医学院二O一三年六月lIIIIIIIII111111111111IIlY2394

2、080华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密否如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：讲会娟时间：加·；年彩月尹日学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存

3、、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阗览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力．注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权书．学位论文作者签名：钟会娟导师签名：而云策签名日期：加J刍

4、年多月罗日签名日期：加厂3年多月f；日泛素特异性蛋白酶USP25调节干扰素信号通路的分子机制目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．iABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯iii缩略语表(ABBREVIATION)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．vi第1章文献综述⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一l1．1天然免疫简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．2泛素化修饰的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．3泛素化途径在干扰素信号通路中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6第2章研究目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第3章材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93．1．1毒株与菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93．1．2细胞以及转染相关材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．93．1．3载体构建所需材料及获赠载体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯．93．1．4WesternB10t以及免疫共沉淀实验所需的材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。1l3．1．5培养基及其配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l3．1．6主要缓冲液与相关试剂及其配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯123．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．133．2．1细胞总RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．133．2．2限制性内切酶酶切反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯143．2．3PCR产物或酶切产物的电泳检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

7、⋯143．2．4外源DNA片段与质粒载体的连接反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．143．2．5大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．143．2．6连接产物的转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯153．2．7重组质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯153．2．8人的USP25及其突变体的表达质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．153．2．9荧光素酶报告基因实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．2．10USP25干扰分子的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．

8、．163．2．11实时定量RT．PCR检测基因mRNA水平⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．173．2．12WesternBlot样品制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．173．2．13免疫共沉淀技术检测蛋白泛素化水平⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．183．2．14体外去泛素化实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯