新城疫病毒p基因编码蛋白拮抗ⅰ型干扰素信号通路的机制研究

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1、新城疫病毒P基因编码蛋白拮抗I型干扰素信号通路的机制研究MechanismofNewcastleDiseaseVirusPGeneEncodedProteinsBlockingTypeIInterferonSignallingPathways【本文受国家自然科学基金青年项目(31101822)：国家高技术研究发展计划重大项N(2011AAl0A209)；江苏省青蓝工程；江苏高校优势学科建设工程项目资助】研究生：傅强专业：预防兽医学导师：彭大新教授丁铲研究员陈素娟副教授扬州大学兽医学院2013年6月傅强：新城疫病毒P基因编码蛋白拈抗I型干扰素信号通路的机制研究新城疫病毒P基因编码蛋白

2、拮抗I型干扰素信号通路的机制研究研究生：傅强导师：彭大新教授丁铲研究员陈素娟副教授摘要新城疫(NewcaStleDisease，ND)是由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)强毒株引起的烈性、高度接触性传染病，在世界范围内流行，感染多种禽类，给养禽业造成巨大经济损失。NDV基因组结构为3’-NP⋯PMF．HN．L．5’，其中P基因能通过“RNA编辑”产生结构蛋白P及非结构蛋白V和W，P／V／W蛋白具有相同的氨基端和不同的羧基端。NDVV蛋白被认为是毒力因子之一，与其IFN通路拮抗能力有关，也与NDV溶瘤特性相关。目前关于NDVV蛋白拮抗IFN信号具体机制

3、的研究尚不多见，有研究表明v蛋白能通过降解STATl(Signaltransducerandactivatoroftranscription1，STATl)发挥阻断IFN信号的作用。然而另一研究结果发现，在NDV感染细胞及V蛋白过表达细胞系中，STATl蛋白能与V蛋白共存，暗示存在其他的IFN信号阻断机制。为了进一步研究v蛋白拮抗IFN信号的具体机制，本文通过多种NDV毒株感染多种细胞，以及NDV真核表达质粒转染等技术手段，检测IFN信号通路中关键蛋白的表达水平及磷酸化修饰水平，鉴定与之相关的病毒蛋白，阐明其作用机制。最终，利用V蛋白缺失株ZJl-Vs对实验结果进行验证。本研究的结

4、果为NDVP基因编码蛋白P／V／W在拮抗I型IFN信号通路中的功能提供了新的见解。1．三种基因型NDVP／V／W真核表达质粒构建及多克隆抗体的制备为获得检测V蛋白表达的抗体，本研究通过扩增NDV9a5b毒株V蛋白PNT结构域扬卅『大学硕士学位论文II和CTD结构域，以及ZJl毒株V蛋白CTD结构域，连入原核表达载体pET-28a或pColdTF进行原核表达，蛋白纯化后免疫小鼠，获得9a5bV蛋白和ZJlVCD多克隆抗体。同时利用OverlappingPCR构建了9a5b、LaSota和ZJl毒株V和w蛋白真核表达质粒。结果显示，9a5bV蛋白多抗和ZJlVCD多抗反应性良好，可用于

5、V蛋白表达检测。9a5b、LaSofa和ZJl毒株V和W蛋白真核表达质粒也构建成功并正确表达。NDV感染人源细胞系HeLa和禽源细胞系DFl后V蛋白表达存在宿主差异，易感宿主鸡源DFl细胞中V蛋白表达量更高，而在哺乳动物细胞中，V蛋白并不能有效表达。2．NDVV蛋白介导STATl降解的毒株差异分析为验证NDV对IFN信号通路中关键蛋白STATl的作用，本实验使用9a5b、LaSota和ZJl等NDV毒株感染和V蛋白真核表达质粒转染HeLa和Vero细胞。Western-blot检测相关蛋白的表达水平，比较转染、感染单一作用或共同作用下，细胞内STATl的变化水平。结果发现，NDV感

6、染HeLa和Vero细胞STATl降解不明显，转染V蛋白后也得到同样的结果。有趣的是，只有在转染V蛋白后感染NDV，STATI才出现明显的降解，且不同毒株之间存在差异。该结果表明，V蛋白对STATl的降解作用受到毒株差异、感染后细胞生物学活动变化或其他病毒蛋白的影响。3．NDVP基因编码蛋白对STATl磷酸化水平的影响及反向遗传毒株验证根据上述实验结果，我们推测V蛋白可能通过其他途径间接地诱导STATl蛋白的降解。众所周知，STATl蛋白磷酸化是IFN信号通路激活的重要环节。为验证V蛋白是否与磷酸化STATl(p—STATl)相互作用，本研究通过外源IFN一(it刺激，NDV感染及

7、真核表达质粒转染，泛素抑制剂处理，并最终通过反向遗传V蛋白缺失株ZJl．Vs验证，NDVV蛋白通过针对性介导p—STATl蛋白发生泛素蛋白酶体依赖的降解来发挥拮抗IFN信号的作用，同时还发现一些毒株P和w蛋白也具有V蛋白样功能。此外，IFN．Y刺激实验显示，NDV无法抑制IFN-7诱导的P—STATl产生，表明NDV能拮抗I型IFN信号而不影响II型IFN系统。本研究阐明了NDV拮抗IFN信号通路的具体机制，同时首次发现NDVP基因编码蛋白P／V／W蛋白具有相似的功能