阻断泛素—蛋白酶体通路诱导白血病细胞凋亡及机制探讨

《阻断泛素—蛋白酶体通路诱导白血病细胞凋亡及机制探讨》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、阻断泛素■蛋白酶体通路诱导白血病细胞凋亡及机制探讨“兰雨^张学敏2胡美茹I杨怡彳杨平地彳沈倍奋I（军事医学科学院基础医学研究所1,仪器恿试中心'北京100850）摘要泛素-蛋白酶体系统畏真核细胞内降解调节因子等各种短寿蛋白的重要途径c趺实验就阻断泛素化通路诱发白血病细胞凋亡及其机制进行了初步探讨「应用MTT法显示蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO对多种白血病细胞系呈剂董依赖性的细胞杀伤作用c流式细胞仪检测提示细胞出現凋亡，并经DNA琼脂糖凝胶电泳和形态学观察得到进一步证实。通过对M-07e细胞裂解物做免疫印迹捡测，发现在Z-LLL-CHO作用过程中Bd-2蛋白被酶解及ca

2、spase-3酶原发生降解.色敏比色法检测显示caspase-3在凋亡过程中被激活而同为bcl-2高表达的白血病细胞系KG-la对LLL-CHO诱导凋亡不敏感，提示不同细胞对阻断泛素化通珞敏惑与否与Bcl-2蛋白表达量无关，而可能与细胞內caspaseV的激活及bcl-2是否发生酶解有关。关键词泛素-蛋白酶体通路蛋白酶依抑制剂中国图书资料分类法分类号R733・7细胞羽亡白血病细胞caspase-3泛素.蛋白酶体系统是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一•它参与了细胞内许多取要的生理和生化过程（如DNA修复、细胞周期的运转、信号传导、抗原的呈递、蛋白的跨膜定位等）。

3、蛋白酶体抑制剂通过对泛素化通路的阻断町诱导多种人肿瘤细胞凋亡，被认为可发展为很有前途的抗肿瘤药物工，但其作用机制至今仍未完全弄清。我们通过观察蛋白酶体抑制剂乙LLL-CHO作用于人白血病细胞系M・07e及KGla厉的效应及细胞中caspase-3及bcl-2的变化，拟对其诱导细胞凋亡的机制进行初步探讨。材料与方法药物及试剂蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO购自CalBio-chem,以DMSO配成100mmol/L的贮存液，-20t保存，用时稀释。鼠抗人Bcl・2单抗（SC-5O9）和鼠抗人caspase-3单抗（SC-7272）购于SantaCruzBiotechno

4、logy,Inc（SantaCruz,CA）cECL试剂购自AmershamPharmaciaBiotechcCaspase-3显色底物I（Ac-DEVD-pNA）购自CalBiochem,以DMSO配成100mol儿的叱存液，-20X：保存，用时稀释。其他试剂由军事医学科学院基础医学研究所四室提供亠细胸培养人巨核细胞白血病细胞系M-07e,由军事戻学科学院基础医学研究所四室提供，悬浮培养在含10%灭活小牛血清的DMEM中，加rhGMCSF30ng/mL在5%CO2,371和饱和湿度条件下培养，2-3天换液1次。人急性髓系白血病细胞系KGla,由军事医学科学院基砒医学研

5、究所四室提供c悬浮培养在含10%灭活小牛血清的RPM11640培养液中，培养条件为5%CQ,371C，饱和湿度,2-3天换液1次。实验均取对数生长期细胞,实验细胞浓度为（0.5-1）/106/mLMTT法测定细胞的生长抑制效应梅对数生长期的细胞悬液1（0.5-l）x10°细胞/孔〕接种于96孔板，加入药物浓度分别为0,1,2.5,5,10"nol/I-的ZLLL-CHO至终体积100诃,另设不加细胞的培养液孔为本底组，共卿育24小时,采用MTT法,测570nmOD值,计算细胞存活率=（给药组OD-本底组OD”（空白对照组OD-本底组OD）,绘制剂量效应曲线。实验重复3次

6、c流式细胞术（PI染色）测定细胞周期与Z-LLL-CHO孵育24小时后收集细胞，PBS•本课题受国家自然科学基金资助编号30070377'海军总医院血液科北京10M372000-10-27收稿；2001-03-01接受洗涤后，70%乙醇41、固定过夜■离心后PBS洗】次，加人RNaseA至终浓度为1mg/ml,37t孵疔30分钟后•加人碘化丙银（FI）染液至终浓度50Mg/ml,4匸避光染色30分钟上机细胞基因组DNA提取及DNA琼脂糖凝胶电泳ZLLL-CHO解育24小时后收集细胞,PBS洗涤后，采用常规法提取基因组DNA：加含蛋白酶K的细胞裂解液0.5ml,37V-水

7、浴过夜，等体积酚和氯仿及异丙醇各抽提一次•加1/10体积3mol/L醋酸钠和2.5倍体积无水乙W-20X：沉淀5小时后离心10000zg20分钟•去上清.70%乙醇洗】次，晾干，溶于TE缓冲液•加RNA酶31X2消化30分钟后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（恒电压80V■约60分钟）。紫外灯观察•照相。细胞形态观察Z-LLL^CHO作用细胞24小时后，收集细胞•离心涂片机涂片，瑞氏•吉姆萨染色•光镜观察。蛊白电泳及免疫印迹全细胞裂解液加入等体积的含2-疏基乙醇（】mmol/L）的2^SDS样品缓冲液并煮沸5分钟'样品在8x]0cm大小的12%