探讨黄芪保护age诱导内皮细胞凋亡的作用及机制

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1、探讨黄芪保护AGE诱导内皮细胞凋亡的作用及机制　　糖尿病患者动脉粥样硬化性心脏病的发病率较非糖尿病患者明显增加，且呈现加速进展态势，其形成的确切机制尚未完全清楚。研究表明：糖尿病患者体内晚期糖基化终末产物（advancedglycationend-products，AGE）的形成和不断累积与动脉粥样硬化的发生和发展关系密切。动脉粥样硬化（AS）病变始于内皮损伤，而AGE可作用于细胞表面特异性受体RAGE（receptorofAGE），使内皮细胞凋亡增多、增生减少；诱导发生氧化应激，产生自由基导致氧化损伤、血管收缩和促凝血状态、刺激细胞因子等释放，加

2、剧血管壁的炎症过程发挥其致动脉粥样硬化的效应。如何延缓甚至逆转糖尿病加速AS的发展进程是近来研究的热点。黄芪注射液为中药黄芪提取物制成的针剂，其主要成分黄芪多糖（astragaluspolysaccharides，APS）可双向调节血糖及增强机体免疫功能，对糖尿病心血管并发症如AS的发生发展也有一定的保护作用。本研究旨在观察体外培养环境下黄芪是否具有保护晚期糖基化终产物诱导内皮细胞凋亡效应的作用及可能的机制。　　1、材料与方法　　1．1主要材料　　黄芪注射液由成都地奥制药公司生产，规格1g／mL。内皮细胞基础培养基（EBM－2）购于Lonza公司。

3、胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）购于Gibco公司。ROS荧光检测试剂盒（Image－iTLIVEGreenROSDetectionKit）购于MolecularProbes公司。DMSO、N－乙酰－L－半胱氨酸（NAC）购自Sigma公司。人凋亡因子FASELISA试剂盒购于R＆D公司。MTS检测试剂盒购于美国Promega公司。其它试剂为国产分析纯。　　1．2体外制备晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白　　人血清白蛋白（HSA）0．2g，D－葡萄糖3．0g共溶于10mL0．5磷酸盐缓冲液（PBS）中（pH7．4），使HSA终浓

4、度为20g／L，D－葡萄糖为1．67mol／L，室温下搅拌5h，用孔径为0．22μm的针头滤器过滤灭菌后，封装置于37℃恒温箱孵育90天后取出，于20mmol／LPBS中充分透析后备用。用Brad-ford法检测AGE浓度。　　1．3内皮细胞培养　　原代人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）购于Cellapplica-tions公司。培养液为含10％FBS的EBM－2培养基。经0．25％胰蛋白酶和0．01％的EDTA混合液消化10分钟，离心后用少量培养基重新悬浮，转入5％CO2培养箱中进行原代培养，培养3～4天后更换含有10％的FBS、青霉素10

5、0u／mL及链霉素100u／mL的EBM－2培养液，待细胞生长融合达80％后，胰酶消化、传代。取第3～4代细胞用于实验研究。　　1．4细胞增殖测定　　按照美国Promega公司MTS检测试剂盒说明书操作。收集处于对数生长期的细胞，以含10％的胎牛血清的EBM－2培养基稀释至1105／mL，接种至96孔细胞培养板，每孔接种0．1mL培养过夜，使细胞贴壁，按既定方案分组，孵育24h后，每孔加入20μL的MTS溶液，37℃，5％CO2培养箱温育4h，用酶标仪测定490nm波长处的吸光值，计算细胞增殖率。　　1．5激光共聚焦检测细胞内氧自由基ROS变

6、化　　按照Image－iTLIVEGreenReactiveOxygenSpeciesDetec-tionKit说明书操作。简要操作方法：移除细胞培养基，37°CPBS中清洗细胞3次，每次5分钟，防止细胞脱落；配制25μMcarboxy－H2DCFDA＋1．0μMHoechst工作液，300μL覆盖细胞，湿润环境下培育30分钟，室温，避光。在PBS中清洗细胞3次，每次5分钟。甘油封片，激光共聚焦显微镜检测。　　1．6FASELISA检测　　取各组细胞培养液上清用于FAS检测。操作按R＆D公司FAS／CD95ELISA试剂盒

7、说明，用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。每次实验每组设3个复孔，重复3次。用CurveExperts1．3软件算出对应浓度。　　1．7统计学分析　　实验结果用均数±标准差表示，采用SPSS18．0统计软件包进行单因素方差分析，以P＜0．05为差异有显著性。　　2、结果　　2．1黄芪对AGEs诱导内皮细胞凋亡的影响　　将HCAECs以2106细胞／mL接种至60mm培养皿中，将培养至融合状态的细胞分组：正常对照组、AGE损伤组（终浓度为5、10、20、40mg／L）。经过单因素方差分析发现：与空白组相比，终浓度为5

8、mg／LAGE即可使细胞明显损伤（P＜0．05）（图1A）。选择损伤较明显的AGE20mg／L组，30min后予加低、中、