mirna-720对tnf-α诱导人脐静脉内皮细胞凋亡作用及机制

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1、万方数据原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：梦学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究

2、所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：拯导师签日期：兰生年三月兰日万方数据博士学位论文中文摘要miRNA．720对TNF．q诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用及机制摘要研究目的1建立原代人脐静脉内皮细胞(瑚ⅣEC)体外培养的方法，讨论TNF一0【对该细胞凋亡程度的影响；2根据发表的论文中相同筛选方式的结果，探讨miRNA．720在HUVEC凋亡中的调节功能；3研究miRNA一720对细胞凋亡影响的机制。研究方法本实验分为三部分：l原代细胞的培养方法参考相关文献报道并加以改进，通过观察细胞形态和利用免疫细胞化学法对细胞进行鉴定；用四种方法

3、(电镜观察，Hoechst33258荧光染色，TUNEL法以及westernblot)检测HUVEC的凋亡程度；2参考文献中有关芯片检测结果，选定miRNA．720为有意义的共同差异表达microRNA。采用miRNA-720前体(pre—miR-720)瞬时转染HUVEC从而使得内皮细胞抑制或者过表达该microRNA，设立空白对照组，用实时荧光定量PCR法检测转染的效率。然后用TNF．a干预转染后的HUVEC，再次通过Hoechst33258荧光染色、TUNEL法、实时定量PCR法以及westernblot等方法检测不同转染组与对照组的内皮细胞凋亡程度改变；3使用生物信息学软件分析，

4、结合文献查询，预测与凋亡相关的miR．720的靶基因；用荧光素酶报告基因法验证DNMT3A是否为miR-720作用的靶基因；用miRNA．720抑制剂转染HUVEC，采用实时荧光定量PCR法和westernblot观察其是否引起靶基因表达增多；II万方数据博士学位论文中文摘要用DNAMethylationPCR检测细胞内基因甲基化的变化。研究结果(1)经相差显微镜观察以及VIII因子染色证明培养的细胞中98％为HUVEC，台盼蓝染色显示95％以上细胞的存活状态良好，TNF一Ⅸ能引起HUVEC凋亡；(2)Hoechst33258荧光染色，TUNEL染色，实时荧光定量PCR及westernb

5、lot结果显示：miRNA．720抑制剂使得TNF．0L诱导的HUVEC凋亡数量明显减少，而miRNA．720的过表达使得TNF。伐诱导的HUVEC凋亡数明显增加；(3)经过生物信息学软件的分析预测，DNMT3A很有可能是miRNA．720的候选靶基因，经过荧光素酶报告基因法，实时定量PCR，Westernblot和MSP证实miRNA．720抑制组该基因的表达有显著提升。研究结论(1)本研究以成功建立HUVEC体外培养方法为基础，建立了TNF．Ⅸ诱导HUVEC凋亡的实验模型；(2)miRNA．720在TNF—a诱导的HUVEC细胞凋亡中表达明显上升，能明显促进细胞凋亡，破坏细胞生存。(

6、3)miRNA．720促进由TNF一伐介导的HUVEC凋亡的作用机理有可能是通过转录后水平抑制DNMT3A的表达来完成。关键词microRNA；内皮细胞；凋亡；TNF．Ⅱ；甲基化万方数据博士学位论文英文摘要TheEffectsofmicroRNA--720onTNF—-ainducedApoptosisofPrimaryUmbilicalVeinEndothelialCellsABSTRACTobjective：(1)Toestablishculturingtechniqueofprimaryhumanumbilicalveinendothelialcells(Hn吧C)invitro．

7、Toinvestigatetheinfiue—neeofTNF—QonapoptosisofHUVECs；(2)AccordingtothemicroRNAmicrochipresultsinourpreviouslypublicatedpapers，wewillinvestigatetheroleofmicroRNA--720playedinTNF·-ainducedHUVECapoptosis；(3)Toinvestigatet