mcp-1诱导人脐静脉内皮细胞株凋亡的途径

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1、遵义医学院硕士学位论文MCP．1诱导人脐静脉内皮细胞株凋亡的途径现在越来越多的研究表明，趋化因子及其受体可通过不同的调控途径对凋亡进行调节，一方面诱导某些细胞发生凋亡，另一方面又可增强其它一些细胞的抗凋亡活性。由此，趋化因子及其受体与细胞凋亡间的关系十分密切。然而要阐明两者间的关系及相互作用的机制，仍需要做大量的研究工作。单核细胞趋化蛋白-1(Monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)，是第一个被克隆鉴定的CC类家族趋化因子，由76个氨基酸残基构成，呈碱性【巧】。含有4个半胱氨酸，分别在1l、12、36、

2、52号位上【91。从二级级结构来看，MCP-1含有N端、Bl(25"--31位氨基酸)、B2(40---,45位氨基酸)和B3(50---53位氨基酸)3个方向平行的B片层结构及a螺旋的C端【16】。MCP—l在动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)的启动中起着至关重要的作用。MCP-1通过与单核细胞表面的受体结合后，使血液中的单核细胞在动脉内皮下的募集，活化为巨噬细胞，提取已进入内膜并发生修饰的脂蛋白，而形成泡沫细胞【17．181，血液中的单核细胞在动脉内皮下募集是As的早期病变。近年还发现，无论是在动物模型还是在人类临床研

3、究中，均发现MCP-1在As损伤中有很高的表达【19-201，并且证实多种促进As的刺激因素均可引起MCP—l的高表达【21‘22】，随As程度加重MCP—l表达增加。同时实验还证明MCP-1抗体或MCP-1受体的抗体均可抑制动脉损伤的发展。MCP-I还可以诱导平滑肌细胞增殖及组织因子表达【231，后者可启动凝血机制，是As斑块表面形成血栓的主要因素。这些均表明MCP-1在As等心血管疾病的慢性炎性反应中充当一个关键角色。因此，进一步深入研究MCP—l的功能以及其在动脉粥样硬化发病中的作用，可能会为治疗As寻找到新的靶点及提供一条新思路。新

4、近的研究发现【241，MCP-1不仅是趋化激活剂，参与了多种炎症的发生，还具有一些新的生物学功能。本室2006年发现【25】，不同浓度MCP一1(0．1ng／mL，1．Ong／mL，lOng／mL，lOOng／mL)作用于体外培养的人脐静脉内皮细胞(hUVEC)后，能诱导hUVEC的凋亡，其效应随浓度和时间的增加而增强，并能抑制Bc卜2的表达，促进Fas、Bax的表达。2007年进一步研究发现：MCP-I作用hVECs后，细胞内线粒体膜电势降低，[Ca2+]浓度升高，Caspase一9活性增强。这些资料提示：MCP-1诱导内皮细胞凋亡可能通

5、过线粒体途径进行，但证据仍不够充分，如细胞内CytC含量是否有变化、Caspase-9表达量是否有变化等，这些问题值得进遵义医学院硕：}学位论文MCP．1诱导人脐静脉内皮细胞株凋产的途径一步探索。细胞凋亡过程存在一个复杂的调控网络，不止一种机制参与其中，其凋亡机理可能涉及几条信号途径的交联对话，它们之间互相依赖，互相影响，共同协调着细胞凋亡的过程。因此本课题拟在课题组前期实验结果的基础上，进一步研究MCP一1诱导人脐静脉内皮细胞株凋亡的线粒体途径，并探讨p53途径与此凋亡事件的关系，这对认识趋化因子的多重生物学功能及诱导细胞凋亡的机制很有必

6、要。本文主要研究内容如下：(一)进一步确证MCP-1是否通过线粒体途径诱导人脐静脉内皮细胞株(hVECs)凋亡：(二)研究以p53为中心的凋亡途径是否参与了MCP-1诱导人脐静脉内皮细胞株(hVECs)的凋亡。遵义医学院硕：卜学位论文MCP．1诱导人脐静脉内皮细胞株凋亡的途径材料与方法1实验材料与仪器1．1材料HVECs(CRL-1730)F12干粉培养基胎牛血清胰蛋白酶青霉素、链霉素GlutamineMcP．1ECGS兔抗人八因子相关抗原单克隆抗体FITC标记山羊抗兔IgG鼠抗人Caspase一9单克隆抗体HRP标记山羊抗小鼠鼠抗人Cyt

7、C单克隆抗体FITC标记山羊抗鼠IgGHEPES、DMSO鼠抗人p53单克隆抗体Actin抗体TrisNA0PVDF膜SDSTriton——100Western及IP细胞裂解液蛋白Maker美国ATCC公司Gibco公司杭州四季青公司上海生物工程有限公司华北制药厂AMRESCO进口分装美国Peprotech公司Upstate公司北京中杉生物技术公司SantaCruz公司Jackson进口分装SantaCruz公司北京中杉生物技术公司AMRESC0进口分装SataCruz公司碧云天公司美国Promega公司Biotium公司Millipore

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